Tradičné diagnostické stratégie na zisťovanie infekčných chorôb si vyžadujú použitie stolných prístrojov, ktoré nie sú vhodné na testovanie v mieste starostlivosti (POCT).Vznikajúca mikrofluidika je vysoko miniaturizovaná, automatizovaná a integrovaná technológia, ktorá je potenciálnou alternatívou k tradičným metódam pre rýchlu, lacnú a presnú diagnostiku na mieste.Molekulárne diagnostické metódy sú široko používané v mikrofluidných zariadeniach ako najúčinnejšie metódy na detekciu patogénov.Tento prehľad sumarizuje nedávny pokrok v mikrofluidnej molekulárnej diagnostike infekčných chorôb z akademického aj priemyselného hľadiska.Najprv popisujeme typické spracovanie nukleových kyselín na čipe, vrátane predbežnej úpravy vzorky, amplifikácie a čítania signálu.Potom sa porovnajú charakteristiky, výhody a nevýhody štyroch typov mikrofluidných platforiem.Ďalej budeme diskutovať o použití digitálnych testov na absolútnu kvantifikáciu nukleových kyselín.Klasické aj súčasné komerčné molekulárne diagnostické zariadenia na mikrofluidnej báze sú zhrnuté ako dôkaz súčasného stavu na trhu.Nakoniec navrhujeme budúce smerovanie mikrofluidnej diagnostiky infekčných chorôb.
Infekčné choroby spôsobujú patogény, vrátane baktérií, vírusov a parazitov, ktoré sú rozšírené po celom svete.Na rozdiel od iných chorôb sa patogény rýchlo infikujú a šíria medzi ľuďmi a hostiteľskými zvieratami prostredníctvom očkovania, vzduchu a vody [1].Prevencia infekčných chorôb je kritická ako opatrenie verejného zdravia.Tri hlavné stratégie boja proti infekčným chorobám: (1) kontrola zdroja infekcie;(2) prerušenie prenosovej cesty;(3) ochrana náchylných populácií.Spomedzi hlavných stratégií je kontrola zdroja infekcie považovaná za najdôležitejšiu stratégiu pre jej pohodlie a nízku cenu.Rýchla diagnostika, izolácia a liečba infikovaných jedincov sú kritické a vyžadujú si rýchle, citlivé a presné diagnostické stratégie [2].Súčasná diagnostika infekčných chorôb zvyčajne kombinuje klinické vyšetrenie založené na príznakoch a symptómoch a laboratórne štúdie, ako je bunková kultúra a molekulárna diagnostika, ktoré si vyžadujú vyškolený personál, prácne postupy a drahé testovacie zariadenia [3, 4].Prevencia prepuknutia infekčných chorôb si vyžaduje rýchlu, nenákladnú a presnú lokálnu diagnostiku, najmä v oblastiach s obmedzenými zdrojmi, kde sú infekčné choroby bežné a závažné [5], ako aj liečbu v divočine alebo na bojisku, kde sú mimoriadne situácie nepredvídateľné..lekárska starostlivosť je obmedzená [6].V tomto kontexte je mikrofluidika technológia, ktorá kombinuje technológie mikroelektromechanických systémov, nanotechnológie alebo vedy o materiáloch na presnú manipuláciu s tekutinami [7,8,9,10], čím poskytuje nové možnosti detekcie v mieste starostlivosti (POCT).) infekčné agens mimo nemocníc a laboratórií.V porovnaní s tradičnou časovo náročnou diagnostikou ponúka mikrofluidná technológia úsporu vzoriek a nákladov na molekulárnu diagnostiku počas prepuknutia choroby.Globálne šírenie koronavírusovej choroby 2019 (COVID-19) je spôsobené ťažkým akútnym respiračným syndrómom koronavírusom 2 (SARS-CoV-2), preto sa opäť zdôrazňuje význam mikrofluidiky pre včasnú prevenciu a kontrolu pandémie [11, 12 , 13].Na rozdiel od tradičnej diagnostiky mikrofluidný POCT používa malé prenosné zariadenia od stolných analyzátorov až po malé testovacie prúžky s bočným prúdom na testovanie v blízkosti miesta odberu vzoriek [14].Tieto testy sa vyznačujú jednoduchou alebo žiadnou prípravou vzorky, rýchlym zosilnením signálu a citlivým odčítaním signálu, výsledkom čoho je krátke trvanie a presné výsledky v priebehu niekoľkých minút.Dostupnosť a masová výroba zdravotníckych prístrojov na báze mikrofluidov rozšírila ich nákladovo efektívne a priame diagnostické aplikácie mimo nemocnice, v blízkosti pacienta a dokonca aj doma.
Spomedzi existujúcich stratégií diagnostiky infekčných ochorení je molekulárna diagnostika jednou z najcitlivejších [15, 16].Okrem toho sa molekulárna diagnostika často používa ako zlatý štandard na kontinuálnu detekciu COVID-19, ktorá umožňuje priamu detekciu vírusovo špecifických oblastí RNA alebo DNA pred nástupom imunitnej odpovede [17, 18].V aktuálnom prehľade predstavujeme najnovšie pokroky v molekulárnych diagnostických procesoch infekčných chorôb založených na mikrofluidike, od akademického pohľadu až po budúce priemyselné perspektívy (obr. 1).Začneme tromi kľúčovými krokmi pri detekcii nukleových kyselín: predúprava vzorky na čipe, amplifikácia nukleovej kyseliny a čítanie signálu.Potom sme porovnali rôzne typy mikrofluidných platforiem s ich štruktúrou a funkciou, ktoré vykazovali jedinečné vlastnosti (silné a slabé stránky).Digitálna detekcia nukleových kyselín je ďalej diskutovaná a uvedená ako príklad technológie tretej generácie na absolútnu kvantifikáciu molekúl infekčných patogénov.Okrem toho bude predstavených niekoľko typických a najnovších komerčných POCT zariadení, ktoré demonštrujú súčasný stav trhu s mikrofluidným POCT pre molekulárnu diagnostiku.Budeme tiež diskutovať a vysvetľovať našu víziu budúcich aplikácií.
Moduly mikrofluidných čipov na detekciu nukleových kyselín možno rozdeliť do troch kategórií (vzorkovanie, rozpoznávanie a signalizácia) podľa ich funkcií [19].Medzi týmito modulmi modul odberu vzoriek realizuje hlavne lýzu vzorky a extrakciu nukleových kyselín.Senzorový modul riadi hlavne konverziu a amplifikáciu signálov nukleových kyselín.Signalizačný modul deteguje signál konvertovaný a spracovaný snímacím modulom.Na základe procesu detekcie nukleových kyselín na čipe zhrnieme rôzne čipy, ktoré dokážu realizovať funkciu „vstup a výstup“.
Prvým krokom pri detekcii nukleovej kyseliny je extrakcia nukleovej kyseliny, tj izolácia cieľovej nukleovej kyseliny z pôvodnej vzorky.Extrakcia nukleových kyselín sa vykonáva s cieľom vyčistiť nukleové kyseliny od iných molekulárnych kontaminantov, zabezpečiť integritu primárnej štruktúry molekúl nukleových kyselín a optimalizovať výsledky.Extrakcia nukleových kyselín si vyžaduje nevyhnutnú lýzu vzorky a zachytenie nukleových kyselín, ktorých kvalita a účinnosť má obrovský vplyv na výsledky výskumu a diagnostiky.Akékoľvek jemné vedľajšie účinky počas extrakcie môžu obmedziť ďalšiu detekciu.Napríklad metódy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a slučkovej izotermickej amplifikácie (LAMP) sú inhibované niektorými reziduálnymi organickými rozpúšťadlami, ako je etanol a izopropanol v reagentoch na izoláciu nukleových kyselín [20].Extrakcia kvapalina-kvapalina a extrakcia tuhou fázou sú najobľúbenejšie metódy izolácie nukleových kyselín [21], avšak extrakcia kvapalina-kvapalina na čipe je extrémne obmedzená, pretože činidlá používané pri extrakcii kvapalina-kvapalina spôsobujú koróziu väčšiny mikrofluidných čipov. .Tu zdôrazňujeme metódy extrakcie na pevnej fáze založené na mikročipoch a porovnávame ich výhody a nevýhody.
Kremík je substrátový materiál kompatibilný s nukleovými kyselinami vďaka svojej biokompatibilite, stabilite a ľahkej modifikácii [22].Dôležité je, že keď je modifikovaný oxidom kremičitým alebo inými materiálmi, tento kompozit vykazuje vlastnosti adsorbovať negatívne nabité nukleové kyseliny v podmienkach s nízkym pH a vysokým obsahom solí, pričom sa eluuje roztokmi s vysokým pH a nízkym obsahom solí.Na základe tohto javu je možné purifikovať nukleovú kyselinu.
Na extrakciu nukleových kyselín v mikrofluidikách sa použili rôzne formy materiálov na báze oxidu kremičitého, ako sú guľôčky oxidu kremičitého, prášky, filtre z mikrovlákien a membrány oxidu kremičitého [23, 24, 25, 26].V závislosti od vlastností materiálu môžu byť materiály na báze kremíka použité v mikroobvodoch rôznymi spôsobmi.Napríklad granule oxidu kremičitého, prášky a komerčné nanofiltre možno jednoducho umiestniť do pórov alebo mikrokanálov mikrofluidných čipov a pomôcť extrahovať nukleové kyseliny zo vzoriek [27, 28, 29].Povrchovo modifikované silikagélové membrány sa môžu použiť aj na rýchle čistenie DNA od patogénov s nízkymi nákladmi.Napríklad Wang a kol.[30] Kombináciou denaturačných amplifikačných reakcií s výmenou reťazcov sprostredkovanou vezikulami s membránami oxidu kremičitého potiahnutými chitosanovými oligosacharidmi bol predstavený všestranný prenosný systém, ktorý úspešne detegoval 102–108 jednotiek tvoriacich kolónie.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus.a prítomnosť vírusu bola ľahko viditeľná.Powell a kol.[31] Mikročipy na báze kremíka sa potom použili na detekciu vírusu hepatitídy C (HCV), vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV), vírusu Zika a ľudského papilomavírusu a automatickej propagácie, v ktorej bol vyvinutý 1,3 μl kľukatý mikroreaktor na zachytávanie RNA vírusov.a vykonať in situ amplifikáciu.Okrem týchto metód zohrávajú kľúčovú úlohu pri extrakcii nukleových kyselín aj povrchovo modifikované mikrokolóny oxidu kremičitého, pretože geometria a vlastnosti modifikujúceho materiálu výrazne zvyšujú účinnosť extrakcie.Chen a kol.[32] navrhli mikrofluidnú platformu na izoláciu RNA s nízkou koncentráciou založenú na silikónových mikrokolónach potiahnutých aminoskupinou.Toto mikrofluidné zariadenie integruje pole 0,25 cm2 mikropilierov na silikónovom substráte na dosiahnutie vyššej účinnosti extrakcie vďaka dizajnu s vysokým pomerom povrchu k objemu.Výhodou tohto dizajnu je, že mikrofluidné zariadenie môže dosiahnuť až 95% účinnosť extrakcie nukleových kyselín.Tieto stratégie na báze kremíka demonštrujú hodnotu rýchlej izolácie nukleových kyselín pri nízkych nákladoch.V kombinácii s mikrofluidnými čipmi môžu extrakčné stratégie na báze kremíka nielen zvýšiť účinnosť detekcie nukleových kyselín, ale aj uľahčiť miniaturizáciu a integráciu analytických zariadení [20].
Magnetické separačné metódy využívajú magnetické častice na izoláciu nukleových kyselín v prítomnosti vonkajšieho magnetického poľa.Bežne používané magnetické častice zahŕňajú magnetické častice Fe3O4 alebo γ-Fe2O3 potiahnuté oxidom kremičitým, aminoskupinou a karboxylovou skupinou [33,34,35,36].Charakteristickým znakom magnetických častíc v porovnaní s metódami SPE na báze kremíka je ľahká manipulácia a ovládanie pomocou externých magnetov.
Pomocou elektrostatickej interakcie medzi nukleovými kyselinami a oxidom kremičitým, v podmienkach vysokej soli a nízkeho pH, sa nukleové kyseliny adsorbujú na povrchu magnetických častíc potiahnutých oxidom kremičitým, zatiaľ čo v podmienkach nízkej soli a vysokého pH je možné molekuly umyť znova..Magnetické guľôčky potiahnuté oxidom kremičitým umožňujú extrahovať DNA z veľkých objemov vzoriek (400 μl) pomocou magneticky riadeného pohybu [37].Ako demonštráciu Rodriguez-Mateos a kol.[38] použili laditeľné magnety na riadenie prenosu magnetických guľôčok do rôznych komôr.Na základe magnetických častíc potiahnutých oxidom kremičitým možno zo vzoriek odpadovej vody extrahovať 470 kópií/ml genómovej RNA SARS-CoV-2 na detekciu reverznej transkripcie LAMP (RT-LAMP) a odpoveď možno prečítať do 1 hodiny.voľným okom (obr. 2a).
Zariadenia na báze magnetických a poréznych materiálov.Koncepčný diagram mikrofluidného zariadenia IFAST RT-LAMP na detekciu SARS-CoV-2 RNA (upravené z [38]).b Odstredivé mikrozariadenie pre dSPE nukleovej kyseliny bukálneho výteru (upravené podľa [39]).c Zabudovaný koncentrátor vzoriek s vlastným napájaním pomocou karty FTA® (upravené podľa [50]).d Filtračný papier Fusion 5 modifikovaný chitosanom (upravené podľa [51]).SARS-CoV-2 ťažký akútny respiračný syndróm koronavírus 2, izotermická amplifikácia sprostredkovaná reverznou transkripčnou slučkou RT-LAMP, technologickí partneri FTA finders, NA nukleová kyselina
Pozitívne nabité magnetické častice sú ideálne na pripojenie fosfátového hlavného reťazca nukleovej kyseliny.Pri určitej koncentrácii soli môžu byť negatívne nabité fosfátové skupiny nukleových kyselín nabité na povrchu magnetických kompozitných častíc.Na extrakciu nukleových kyselín boli preto vyvinuté magnetické nanočastice s drsným povrchom a vysokou hustotou aminoskupín.Po magnetickej separácii a blokovaní môžu byť magnetické nanočastice a komplexy DNA priamo použité v PCR, čo eliminuje potrebu zložitých a časovo náročných operácií čistenia a elúcie [35].Magnetické nanočastice potiahnuté negatívnymi karboxylovými skupinami sa tiež použili na separáciu nukleových kyselín adsorbovaných na povrchoch vo vysoko koncentrovaných roztokoch polyetylénglykolu a chloridu sodného [36].Pomocou týchto povrchovo modifikovaných magnetických guľôčok je extrakcia DNA kompatibilná s následnou amplifikáciou.Dignan a kol.[39] opísali automatizovanú a prenosnú odstredivú mikrofluidnú platformu na predúpravu nukleových kyselín, ktorá umožňuje jej použitie na mieste netechnickému personálu.Okrem toho kompatibilita izolovanej DNA s LAMP, čo je metóda dobre vhodná na analýzu nukleových kyselín v mieste starostlivosti, ďalej demonštruje minimálne požiadavky na vybavenie a vhodnosť pre kolorimetrické testy (obr. 2b).
Metódy magnetických guľôčok ponúkajú možnosť automatizovanej extrakcie, z ktorých niektoré existujú v komerčných automatizovaných extraktoroch nukleových kyselín [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Čína) a Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].Výhody kombinovania magnetických guľôčok s mikrofluidikami možno využiť na efektívnu automatizovanú extrakciu nukleových kyselín, čo by mohlo potenciálne napredovať vo vývoji molekulárnej diagnostiky;avšak kombinácia magnetických guľôčok s mikrofluidikami sa stále vo veľkej miere spolieha na komplexné riadiace systémy na presnú manipuláciu s magnetickými guľôčkami, čo vysvetľuje popularitu komerčných produktov, ktoré sú objemné a drahé, čo obmedzuje ďalšiu aplikáciu magnetických guľôčok v POCT.
Na detekciu nukleových kyselín sa tiež použilo niekoľko poréznych materiálov, ako sú modifikované nitrocelulózové filtre, karty Finders Technology Associates (FTA), filtračné papiere na báze polyétersulfónu a materiály potiahnuté glykánom [40, 41, 42, 43, 44].Porézne vláknité materiály, ako je vláknitý papier, sa prvýkrát použili na izoláciu DNA fyzickým zapletením molekúl DNA s dlhými vláknami do vlákien.Malé póry vedú k silnému fyzickému obmedzeniu molekúl DNA, čo pozitívne ovplyvňuje extrakciu DNA.V dôsledku rôznych veľkostí pórov vláknitého papiera nemôže účinnosť extrakcie spĺňať potreby amplifikácie DNA [45, 46].FTA karta je komerčný filtračný papier používaný v oblasti súdneho lekárstva a široko používaný v iných oblastiach molekulárnej diagnostiky.Použitím celulózového filtračného papiera impregnovaného rôznymi chemikáliami na lýzu bunkových membrán vo vzorke je uvoľnená DNA chránená pred degradáciou až na 2 roky.Nedávno bol vyvinutý impregnovaný celulózový papier na molekulárnu detekciu rôznych patogénov, vrátane SARS-CoV-2, leishmaniózy a malárie [47,48,49].HIV v izolovanej plazme je priamo lyzovaný a vírusová nukleová kyselina je obohatená o prietokovú membránu FTA® zabudovanú do koncentrátora, čo umožňuje efektívnu produkciu nukleovej kyseliny [50] (obr. 2c).Hlavným problémom detekcie nukleových kyselín pomocou kariet FTA je to, že chemikálie ako guanidín a izopropanol inhibujú následné amplifikačné reakcie.Na vyriešenie tohto problému sme vyvinuli filtračný papier Fusion 5 modifikovaný chitosanom, ktorý kombinuje výhody fyzického prepletania molekúl DNA a vláknitého filtračného papiera a elektrostatickej adsorpcie DNA na zlúčeniny modifikované chitosanom, aby sa dosiahla vysoko účinná extrakcia nukleových kyselín. ..filtračné vlákna [51] (obr. 2d).Podobne Zhu a kol.[52] demonštrovali chitosanom modifikovanú PCR metódu založenú na in situ kapilárnom mikrofluidnom systéme na rýchlu izoláciu a detekciu RNA vírusu Zika.Nukleové kyseliny môžu byť adsorbované/desorbované v zmiešanom médiu lyzát/PCR, v tomto poradí, na základe vlastnosti chitosanu zapnutia/vypnutia.zapnutie a vypnutie“, reagujúce na pH.
Ako je uvedené vyššie, tieto stratégie kombinujú výhody rôznych materiálov v pevnej fáze a zvyšujú účinnosť extrakcie nukleových kyselín v mikrofluidikách.V praktických aplikáciách je použitie týchto materiálov vo veľkých množstvách neekonomické a správna povrchová úprava alebo povrchová úprava bežných materiálov týmito materiálmi môže zachovať ich funkciu.Preto sa predpokladá, že implementácia týchto stratégií po pilotnej štúdii môže znížiť náklady.
Testovanie nukleových kyselín na mikrofluidných platformách často používa malé objemy vzoriek (< 100 µl), preto si vyžaduje amplifikáciu cieľových nukleových kyselín špecifickými sondami na konverziu na signál, ktorý je vhodný pre následnú detekciu (optické, elektrické a magnetické) [53, 54]. Testovanie nukleových kyselín na mikrofluidných platformách často používa malé objemy vzoriek (< 100 µl), preto si vyžaduje amplifikáciu cieľových nukleových kyselín špecifickými sondami na konverziu na signál, ktorý je vhodný pre následnú detekciu (optické, elektrické a magnetické) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Pri testovaní nukleových kyselín na mikrofluidných platformách sa často používajú malé objemy vzoriek (<100 µl), takže je potrebná amplifikácia cieľových nukleových kyselín pomocou špeciálnych sond, aby sa premenili na signál vhodný pre následnú detekciu (optický, elektrický a magnetický) [53, 54].„ ].微流控 平台 上 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 扩增 ， 以 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 的 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 、 下游 （光学 光学 、 、 电学） 的 信号 信号 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Detekcia nukleových kyselín na mikrofluidných platformách zvyčajne využíva malé objemy vzoriek (<100 μl), čo si vyžaduje amplifikáciu cieľových nukleových kyselín špeciálnymi sondami na ich premenu na signály pre následnú detekciu (optické, elektrické a magnetické) [53, 54]] .Amplifikácia nukleových kyselín v mikrofluidikách môže tiež urýchliť reakcie, optimalizovať detekčné limity, znížiť požiadavky na vzorky a zlepšiť presnosť detekcie [55, 56].V posledných rokoch, s realizáciou rýchlej a presnej detekcie, sa v mikrofluidike aplikovali rôzne metódy amplifikácie nukleových kyselín, vrátane PCR a niektorých izotermických amplifikačných reakcií.V tejto časti sú zhrnuté metódy detekcie nukleových kyselín založené na mikrofluidných systémoch.
PCR je simulácia procesu replikácie DNA organizmu, ktorej teória je podrobne opísaná inde a nebude sa tu rozoberať.PCR môže amplifikovať veľmi malé množstvo cieľovej DNA/RNA exponenciálnou rýchlosťou, vďaka čomu je PCR výkonným nástrojom na rýchlu detekciu nukleových kyselín.V posledných desaťročiach bolo vyvinutých veľa prenosných mikrofluidných zariadení vybavených systémami tepelného cyklovania PCR, aby vyhovovali potrebám diagnostiky v mieste starostlivosti [57, 58].On-chip PCR možno rozdeliť do štyroch typov (konvenčná, kontinuálne prietoková, priestorovo prepínaná a konvektívna PCR) podľa rôznych metód regulácie teploty [59].Napríklad Gee a spol.[60] vyvinuli metódu priamej reverznej transkripčnej kvantitatívnej PCR (RT-qPCR) na vlastnej mikrofluidnej platforme na multiplexnú detekciu SARS-CoV-2, vírusov chrípky A a B vo vzorkách výterov z hrdla (obr. 3a).Park a kol.[61] vytvorili jednoduchý čip na analýzu patogénov integráciou tenkovrstvovej PCR, elektród a prstom ovládaného mikrofluidného modulu na báze polydimetylsiloxánu.Obe práce však stelesňujú spoločné nedostatky konvenčnej PCR.PCR vyžaduje tepelné cyklovanie, čo obmedzuje ďalšiu miniaturizáciu zariadenia a skracuje čas testovania.
Na vyriešenie tohto problému je rozhodujúci vývoj mikrofluidnej a priestorovo prepínanej PCR s nepretržitým prietokom.Pomocou dlhého hadovitého kanála alebo krátkeho priameho kanála môže kontinuálna prietoková PCR poskytnúť rýchlu amplifikáciu aktívnou cirkuláciou činidiel v troch zónach predhrievania s čerpadlom mimo čipu.Táto operácia úspešne zabráni prechodovej fáze medzi rôznymi reakčnými teplotami a tým výrazne skráti čas testovania [62] (obr. 3b).V ďalšej štúdii od Junga a spol.[63] navrhli nový rotačný PCR genetický analyzátor, ktorý kombinuje charakteristiky fixnej a prietokovej PCR pre ultrarýchlu a multiplexnú reverznú transkripčnú PCR (obr. 3c).Na amplifikáciu nukleovej kyseliny sa bude mikročip PCR otáčať cez tri zahrievacie bloky pri rôznych teplotách: 1. denaturačný blok 94 °C, 2. blok žíhania pri 58 °C, 3. expanzný blok pri 72 °C.
Aplikácia PCR v mikrofluidike.Schematické znázornenie dirRT-qPCR na mikrofluidnej platforme (upravené z [60]).b Schematické znázornenie kontinuálneho prietokového mikročipu PCR založeného na serpentínovom kanáli (upravené z [62]).c Schematické znázornenie rotačného genetického analyzátora PCR pozostávajúceho z mikročipu, troch vykurovacích blokov a krokového motora (upravené podľa [63]).d Schéma termokonvekčnej PCR s centrifugáciou a nastavením (upravené podľa [64]).DirRT-qPCR, priama kvantitatívna reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia
Pomocou kapilár a slučiek alebo dokonca tenkých doštičiek môže konvekčná PCR rýchlo amplifikovať nukleové kyseliny prirodzenou voľnou tepelnou konvekciou bez potreby externej pumpy.Napríklad mikrofluidná platforma cyklického olefínového polyméru bola vyvinutá na vyrobenom rotačnom ohrievacom stupni, ktorý využíva tepelné cyklovanie s centrifugáciou v mikrokanáli slučky PCR [64] (obr. 3d).Reakčný roztok je poháňaný tepelnou konvekciou, ktorá kontinuálne vymieňa vysokú a nízku teplotu v mikrokanáliku s prstencovou štruktúrou.Celý proces amplifikácie je možné dokončiť za 10 minút s detekčným limitom 70,5 pg/kanál.
Ako sa očakávalo, rýchla PCR je výkonný nástroj pre plne integrované systémy molekulárnej diagnostiky a multiplexnej analýzy odozvy vzorky.Rýchla PCR výrazne skracuje čas potrebný na detekciu SARS-CoV-2, čo prispieva k efektívnej kontrole pandémie COVID-19.
PCR vyžaduje komplexný tepelný cyklovač, ktorý nie je vhodný pre POCT.Nedávno sa na mikrofluidiky aplikovali techniky izotermickej amplifikácie, vrátane, ale bez obmedzenia, LAMP, amplifikácie rekombinázou polymerázou (RPA) a amplifikácie založenej na sekvenciách nukleových kyselín [65,66,67,68].Pomocou týchto techník sa nukleové kyseliny amplifikujú pri konštantnej teplote, čo uľahčuje vytvorenie lacných, vysoko citlivých prenosných zariadení POCT na molekulárnu diagnostiku.
Vysokovýkonné testy LAMP na báze mikrofluidiky umožňujú viacnásobnú detekciu infekčných ochorení [42, 69, 70, 71].V kombinácii s odstredivým mikrofluidným systémom môže LAMP ďalej uľahčiť automatizáciu detekcie nukleových kyselín [69, 72, 73, 74, 75].Slip-and-react SlipChip bol vyvinutý na vizuálnu detekciu viacerých paralelných baktérií pomocou LAMP [76] (obr. 4a).Pri použití optimalizovanej LAMP v teste bol pomer fluorescenčného signálu k šumu približne 5-násobný a detekčný limit dosiahol 7,2 kópií/μl genómovej DNA. Okrem toho bola na základe metódy vizualizovaná existencia piatich bežných tráviacich bakteriálnych patogénov, vrátane Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis a Vibrio parahaemolyticus za < 60 minút. Okrem toho bola na základe metódy vizualizovaná existencia piatich bežných tráviacich bakteriálnych patogénov, vrátane Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis a Vibrio parahaemolyticus za < 60 minút.Okrem toho bola pomocou tejto metódy vizualizovaná prítomnosť piatich bežných bakteriálnych patogénov tráviaceho traktu, vrátane Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis a Vibrio parahaemolyticus, za menej ako 60 minút.此外 ， 基于 该 在 在 <60 分钟 内 可 了 五 种 常见 常见 细菌病 原体 存在 ， 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 氏 菌 、 河流 弧菌。。。。。。。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 五 种 常见 常见 细菌病 的 存在 ， 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 副溶血 。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPOkrem toho sa pomocou tejto metódy vizualizovala prítomnosť piatich bežných bakteriálnych gastrointestinálnych patogénov, vrátane Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius a Vibrio parahaemolyticus za menej ako 60 minút.
Medzi výhody LAMP v mikrofluidike patrí okrem iného rýchla odozva a miniaturizovaná detekcia.Avšak kvôli reakčnej teplote (okolo 70 °C) sa počas LAMP nevyhnutne vytvárajú aerosóly, čo vedie k vysokej miere falošne pozitívnych výsledkov.Špecifickosť testu, návrh primeru a kontrola teploty musia byť tiež optimalizované pre LAMP.Navyše návrhy čipov, ktoré implementujú detekciu viacerých cieľov na jednom čipe, majú veľkú hodnotu a mali by byť vyvinuté.LAMP je navyše vhodný na viacúčelovú detekciu integrovanú v jednom čipe, čo má veľký význam, no stále je tu veľký priestor na vývoj.
Vysoká miera falošne pozitívnych výsledkov LAMP môže byť čiastočne znížená pomocou RPA, pretože relatívne nízka reakčná teplota (~37 °C) má za následok relatívne málo problémov s odparovaním [77].V systéme RPA dva protiľahlé priméry iniciujú syntézu DNA väzbou na rekombinázu a amplifikácia môže byť dokončená do 10 minút [78,79,80,81].Preto je celý proces RPA oveľa rýchlejší ako PCR alebo LAMP.V posledných rokoch sa ukázalo, že mikrofluidná technológia ďalej zlepšuje rýchlosť a presnosť RPA [82,83,84].Napríklad Liu a kol.[85] vyvinuli mikrofluidný integrovaný test amplifikácie polymerázovej rekombinázy s laterálnym tokom na rýchlu a citlivú detekciu SARS-CoV-2 integráciou reverznej transkripcie RPA (RT-RPA) a univerzálneho systému detekcie testovacích prúžkov s laterálnym tokom.do jedného mikrofluidného systému.Obrázok 4b).Limit detekcie je 1 kópia/µl alebo 30 kópií/vzorka a detekcia môže byť dokončená za približne 30 minút.Kong a kol.vyvinuli nositeľné mikrofluidné zariadenie.[86] použili telesnú teplotu a fluorescenčný detekčný systém založený na mobilnom telefóne na rýchlu a priamu detekciu DNA HIV-1 pomocou RPA (obrázok 4c).Nositeľný test RPA deteguje 100 kópií/ml cieľovej sekvencie do 24 minút, čo demonštruje veľký potenciál pre rýchlu diagnostiku dojčiat infikovaných HIV-1 v prostredí s obmedzenými zdrojmi.
Izotermické zosilnenie pri testovaní na mieste starostlivosti (POCT).Vývoj a výroba spinových a reakčných čipov SlipChip.Po plazmovom zváraní boli horné a spodné triesky spojené so sadou matíc, aby vytvorili finálnu triesku (upravené podľa [76]).b Schéma systému MI-IF-RPA na detekciu COVID-19 (upravené z [85]).c Schéma nositeľného RPA testu na rýchlu detekciu HIV-1 DNA (upravené z [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboxyfluoresceín, vírus ľudskej imunodeficiencie HIV, RPA rekombinázová polymerázová amplifikácia, LED dióda vyžarujúca svetlo, MI-IF-RPA Microfluidics Integrovaná Polymérna mikrofluidáza- Laterálna mikrofluidná rekombináza Amplifikácia
RPA na mikrofluidnej báze sa rýchlo rozvíja, avšak náklady na výrobu čipov a spotreba reakcie sú príliš vysoké a musia sa znížiť, aby sa zvýšila dostupnosť tejto technológie.Okrem toho môže vysoká citlivosť RPA ovplyvniť amplifikáciu nešpecifických produktov, najmä v prítomnosti kontaminácie.Tieto obmedzenia môžu ovplyvniť aplikáciu RPA v mikrofluidných systémoch a zaslúžia si ďalšiu optimalizáciu.Na zlepšenie uskutočniteľnosti mikrofluidných stratégií založených na RPA v POCT sú potrebné aj dobre navrhnuté priméry a sondy pre rôzne ciele.
Cas13 a Cas12a majú schopnosť náhodne štiepiť nukleové kyseliny, a preto môžu byť vyvinuté ako detekčné a diagnostické nástroje.Cas13 a Cas12a sú aktivované po väzbe na cieľovú DNA alebo RNA, v danom poradí.Po aktivácii proteín začne štiepiť ďalšie blízke nukleové kyseliny, po čom môžu vodiace RNA zamerané na nukleové kyseliny špecifické pre patogén štiepiť zhášané fluorescenčné sondy a uvoľňovať fluorescenciu.Na základe tejto teórie Kellner a spol.[87] vyvinuli metódu založenú na Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] a Broughton a kol.[88] vyvinuli ďalší prístup založený na Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
V posledných rokoch sa objavili rôzne metódy na detekciu nukleových kyselín na báze CRISPR [89, 90].Konvenčné metódy založené na CRISPR sú často časovo náročné a náročné na prácu v dôsledku viacerých postupov vrátane extrakcie nukleových kyselín, amplifikácie a detekcie CRISPR.Vystavenie tekutín vzduchu môže zvýšiť pravdepodobnosť falošne pozitívnych výsledkov.Vzhľadom na vyššie uvedené, systémy založené na CRISPR nutne potrebujú optimalizáciu.
Pre aplikácie detekcie CRISPR-Cas12a a CRISPR-Cas13a bola vyvinutá pneumaticky riadená mikrofluidná platforma, ktorá dokáže vykonávať 24 analýz paralelne [91].Systém je vybavený zariadením na detekciu fluorescencie, ktoré obchádza amplifikáciu nukleových kyselín a automaticky deteguje vzorky femtomolárnej DNA a RNA.Chen a kol.[92] integrovali amplifikáciu rekombinázy so systémom CRISPR-Cas12a v centrifugálnych mikrofluidikách (obr. 5a).Táto práca prekonáva ťažkosti s integráciou týchto dvoch procesov, pretože Cas12a môže stráviť messengerovú DNA a inhibovať proces amplifikácie.Okrem toho Chen a kol.[92] navyše vopred uložil reakčné činidlá v odstredivej mikrofluidnej kontrole, aby sa celý proces automaticky dokončil.V inej práci Silva a spol.[93] vyvinuli diagnostickú metódu bez amplifikácie CRISPR/Cas12a a smartfón na detekciu SARS-CoV-2 (obr. 5b).Tento test, známy ako systém bez amplifikácie na báze mobilného telefónu, zahŕňa enzým závislý od CRISPR/Cas, ktorý je založený na vizualizácii bublinových signálov generovaných katalázou v mikrofluidných kanáloch smartfónom.Citlivá detekcia menej ako 50 kópií/µl nukleovej kyseliny bez predamplifikácie, celý proces od vstreknutia vzorky po odčítanie signálu trvá len 71 minút.
Metódy detekcie nukleových kyselín založené na CRISPR.Centrifugálny POCT pre integrovanú molekulárnu diagnostiku na báze CRISPR (upravené podľa [92]).b Vývoj CASCADE testu pre analýzu SARS-CoV-2 pomocou smartfónu (upravené z [93]).Rekombinázová amplifikácia RAA, motív protospaceru priľahlý k PAM, klastrované krátke palindromické opakovania CRISPR v pravidelných intervaloch, systém CASCADE bez amplifikácie mobilného telefónu s enzýmami závislými od CRISPR/CAS, hydrochlorid 1-etyl-3-[3-dimetylaminopropyl]karbodiimidu EDC
Ako posledný krok v detekcii nukleových kyselín, detekcia signálu priamo odráža diagnostické výsledky a je kritickým faktorom pri vývoji účinného, citlivého a presného POCT.Signály možno čítať pomocou rôznych metód, ako sú fluorescenčné, elektrochemické, kolorimetrické a magnetické stratégie.V tejto časti popisujeme zdôvodnenie každého prístupu a porovnávame molekulárnu diagnostiku infekčných chorôb v mikrofluidike.
Stratégie založené na fluorescencii sa široko používajú na diagnostiku infekčných chorôb POCT kvôli ich pozoruhodným výhodám vynikajúcej citlivosti, nízkej cene, ľahkej prevádzke a analýze v mieste starostlivosti [94, 95].Tieto stratégie využívajú značené fluorofóry, ako sú fluorescenčné farbivá a nanomateriály na vytvorenie detegovateľného signálu (zosilnenie alebo zhášanie fluorescencie).Toto zistenie naznačuje, že stratégie založené na fluorescencii možno rozdeliť na priame fluorescenčné značenie, fluorescenčnú detekciu so zapnutým signálom a vypnutým signálom [96].Priama detekcia fluorescenčných značiek využíva špeciálne fluorescenčné značky na označenie špecifických ligandov, ktoré generujú špecifické množstvo fluorescencie, keď sú selektívne naviazané na cieľ.Pre fluorescenčnú detekciu založenú na signáli kvalita fluorescenčného signálu pozitívne súvisí s veľkosťou záujmu.Intenzita fluorescencie je zanedbateľná v neprítomnosti cieľa a je zistiteľná, keď je prítomné dostatočné množstvo cieľa.Naopak, intenzita fluorescencie detegovaná fluorescenciou s vypnutým signálom je nepriamo úmerná množstvu cieľa, spočiatku dosahuje maximálnu hodnotu a postupne klesá, keď sa cieľ zväčšuje.Napríklad pomocou CRISPR-Cas13a cieľovo závislého trans-štiepiaceho mechanizmu, Tian et al.[97] vyvinuli novú rozpoznávaciu stratégiu na detekciu RNA, ktoré priamo obchádzajú reverznú transkripciu (obr. 6a).Po väzbe na komplementárne cieľové RNA sa môže aktivovať komplex CRISPR-Cas13-RNA, čím sa spustí transkolaterálne štiepenie nešpecifickými reportérovými RNA.Fluorescenčne značený reportér [fluorofór (F)] je zhášaný zhášačom (Q) neporušený a fluoreskuje, keď je odštiepený aktivovaným komplexom.
Výhodou elektrochemickej detekcie je vysoká rýchlosť detekcie, jednoduchá výroba, nízka cena, jednoduché prenášanie a automatické ovládanie.Je to výkonná analytická metóda pre aplikácie POCT.Na základe grafénových tranzistorov s efektom poľa Gao et al.[98] vyvinuli nanobiosenzor na multiplexnú detekciu antigénov lymskej boreliózy z baktérií Borrelia burgdorferi s detekčným limitom 2 pg/ml (obr. 6b).
V aplikáciách POCT sa používajú kolorimetrické testy, ktoré využívajú výhody prenosnosti, nízkej ceny, ľahkej prípravy a vizuálneho odčítania.Kolorimetrická detekcia môže využívať oxidáciu peroxidázy alebo nanomateriálov podobných peroxidáze, agregáciu nanomateriálov a pridanie indikátorových farbív na premenu informácie o prítomnosti cieľových nukleových kyselín na viditeľné farebné zmeny [99, 100, 101].Najmä nanočastice zlata sa široko používajú pri vývoji kolorimetrických stratégií a vzhľadom na ich schopnosť vyvolať rýchle a významné zmeny farieb rastie záujem o vývoj kolorimetrických platforiem POCT na diagnostiku infekčných chorôb in situ [102].Pomocou integrovaného odstredivého mikrofluidného zariadenia [103] je možné alimentárne patogény v kontaminovaných vzorkách mlieka automaticky detegovať na úrovni 10 bakteriálnych buniek a výsledky je možné vizuálne odčítať do 65 minút (obr. 6c).
Techniky magnetického snímania dokážu presne detegovať analyty pomocou magnetických materiálov a v posledných desaťročiach je značný záujem o aplikácie POCT.Techniky magnetického snímania majú niektoré jedinečné výhody, ako napríklad lacné magnetické materiály, a nie drahé optické komponenty.Použitie magnetického poľa však zlepšuje účinnosť detekcie a skracuje čas prípravy vzorky [104].Okrem toho výsledky magnetického sondovania preukazujú vysokú špecifickosť, citlivosť a vysoký pomer signálu k šumu v dôsledku nevýznamného signálu magnetického pozadia biologických vzoriek [105].Sharma a kol.integroval biosenzor na báze magnetického tunelového spojenia do prenosnej mikročipovej platformy.[106] na multiplexnú detekciu patogénov (obr. 6d).Biosenzory citlivo detegujú subnanomolárne nukleové kyseliny izolované z patogénov.
Typická metóda detekcie signálu.Koncept hyperlokalizovanej detekcie Cas13a (upravené z [97]).b Grafénový nanobiosenzorový FET v kombinácii s Lyme GroES scFv (upravené podľa [98]).c Kolorimetrické indikácie pre multiplexnú detekciu alimentárnych patogénov v odstredivom mikrofluidnom čipe: vzorky č. 1 a č. 3 s cieľovými patogénmi a vzorky č. 2, 4 a č. 5 bez cieľových patogénov (upravené podľa [103]) .d Biosenzor na báze magnetickej tunelovej križovatky, vrátane platformy, vstavaného blokovacieho zosilňovača, riadiacej jednotky a napájacieho zdroja pre generovanie/získavanie signálu (upravené z [106]).GFET Grafén FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymetylmetakrylát
Napriek vynikajúcim vlastnostiam vyššie uvedených metód detekcie majú stále nevýhody.Tieto metódy sú porovnané (tabuľka 1), vrátane niektorých aplikácií s podrobnosťami (výhody a nevýhody).
S rozvojom mikrofluidiky, mikroelektromechanických systémov, nanotechnológie a materiálovej vedy neustále napreduje využitie mikrofluidných čipov na detekciu infekčných ochorení [55,96,107,108].Presná manipulácia s miniatúrnym vybavením a kvapalinami prispieva k presnosti diagnostiky a nákladovej efektívnosti.Pre ďalší vývoj sa preto vynaložilo úsilie na optimalizáciu a upgrade čipov, výsledkom čoho sú rôzne mikrofluidné čipy s rôznymi štruktúrami a funkciami.Tu stručne predstavíme niekoľko bežných typov mikrofluidných platforiem a porovnáme ich charakteristiky (výhody a nevýhody).Okrem toho sa väčšina príkladov uvedených nižšie zameriava predovšetkým na boj proti SARS-CoV-2.
LOCC sú najbežnejšie miniaturizované komplexné analytické systémy a ich operácie sú vysoko miniaturizované, integrované, automatizované a paralelné od vstrekovania a prípravy vzorky, riadenia prietoku a detekcie kvapalín [109, 110].Kvapaliny sú manipulované prostredníctvom starostlivo navrhnutej geometrie a interakcie mnohých fyzikálnych efektov, ako sú tlakové gradienty, kapilárne pôsobenie, elektrodynamika, magnetické polia a akustické vlny [111].LOCC vykazuje vynikajúce výhody vo vysokovýkonnom skríningu a viacnásobnej detekcii s vysokou rýchlosťou analýzy, malou veľkosťou vzorky, nízkou spotrebou energie a vysokou účinnosťou riadenia a prevádzky;zariadenia LOCC sú však veľmi chúlostivé a ich výroba, balenie a prepojenie.Avšak multiplexovanie a opätovné použitie čelí obrovským ťažkostiam [96].V porovnaní s inými platformami má LOCC jedinečné výhody z hľadiska maximálnej rozmanitosti aplikácií a najlepšej kompatibility technológií, no zjavné sú aj jeho nevýhody, a to vysoká zložitosť a slabá opakovateľnosť.Závislosť na externých čerpadlách, ktoré sú často objemné a drahé, ďalej obmedzuje ich použitie v POCT.
Počas vypuknutia COVID-19 sa LOCC venovalo veľa pozornosti.Zároveň existuje niekoľko nových čipov, ktoré kombinujú viacero technológií.Napríklad smartfóny sú teraz široko používané ako prenosné analytické zariadenia a majú veľký potenciál pre integráciu LOCC.Sun a kol.[21] vyrobili mikrofluidný čip, ktorý umožňuje multiplexovanie špecifických sekvencií nukleových kyselín piatich patogénov, vrátane SARS-CoV-2, pomocou LAMP a analyzovali ich pomocou smartfónu do 1 hodiny po ukončení reakcie.Ako ďalší príklad Sundah a kol.[112] vytvorili molekulárny prepínač [katalytická amplifikácia pomocou prepínača stavu molekulárneho prechodu (CATCH)] na priamu a citlivú detekciu cieľov RNA SARS-CoV-2 pomocou smartfónov. CATCH je kompatibilný s prenosným LOCC a dosahuje vynikajúci výkon (približne 8 kópií RNA/μl; < 1 h pri izbovej teplote) [112]. CATCH je kompatibilný s prenosným LOCC a dosahuje vynikajúci výkon (približne 8 kópií RNA/μl; < 1 h pri izbovej teplote) [112]. Catch совстим с портативным locc и обеспечивает превосходную производителел (1 п 9 п к/п. CATCH je kompatibilný s prenosným LOCC a poskytuje vynikajúcu priepustnosť (približne 8 kópií RNA/µl; < 1 h pri izbovej teplote) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]） Catch совстим с портативными locc и обладает превосходной произ п к 8 к 9 к [м н н н н н н м м м м м м м м м м [1 н. CATCH je kompatibilný s prenosnými LOCC a má vynikajúci výkon (približne 8 kópií RNA/µl; < 1 hodina pri izbovej teplote) [112].Okrem toho zariadenia LOCC na molekulárnu diagnostiku využívajú aj niektoré hnacie sily, ako napríklad vákuum, napínanie a elektrické polia.Kang a kol.[113] demonštrovali ultrarýchlu nanoplazmovú PCR nanoplazmu na čipe v reálnom čase na rýchlu a kvantitatívnu diagnostiku COVID-19 v teréne pomocou vákuového plazmónového kvapalného PCR čipu.Li a spol.[114] následne vyvinuli mikrofluidný čip poháňaný napínaním, ktorý umožnil diagnostiku COVID-19.Platforma používa amplifikačný systém RT-LAMP na určenie, či je vzorka kvalitatívne pozitívna alebo negatívna.Následne Ramachandran a kol.[115] dosiahli vhodné gradienty elektrického poľa pomocou izotachoforézy (ITP), techniky selektívnej fokusácie iónov implementovanej v mikrofluidike.Pomocou ITP možno automaticky purifikovať cieľovú RNA zo surových vzoriek nazofaryngeálnych výterov.Potom Ramachandran a spol.[115] Kombináciou tohto čistenia ITP s testami LAMP a CRISPR s podporou ITP sa zistil SARS-CoV-2 v ľudskom nazofaryngeálnom výtere a klinických vzorkách za približne 35 minút.Okrem toho sa neustále objavujú nové nápady.Jadhav a kol.[116] navrhli diagnostickú schému založenú na Ramanovej spektroskopii s vylepšeným povrchom v kombinácii s mikrofluidným zariadením obsahujúcim buď vertikálne orientované uhlíkové nanorúrky potiahnuté zlatom/striebrom, alebo jednorazové elektrosprievodňované mikro/nanorúrky.Membránou funkcionalizované vstavané filtračné mikrokanály sú na jedno použitie.Zariadenie adsorbuje vírusy z rôznych telesných tekutín/exsudácií, ako sú sliny, nosohltan a slzy.Vírusový titer je teda bohatý a vírus môže byť presne identifikovaný Ramanovým podpisom.
LOAD je odstredivá mikrofluidná platforma, v ktorej sú všetky procesy riadené frekvenčným protokolom, ktorý otáča mikroštruktúrovaný substrát [110].Zariadenie LOAD sa vyznačuje využívaním odstredivej sily ako dôležitej hnacej sily.Kvapaliny tiež podliehajú kapilárnym, Eulerovým a Coriolisovým silám.Pomocou centrifúgového zariadenia sa analýzy vykonávajú v kontinuálnej kvapalinovej prevádzke od radiálnej dovnútra smerom von, čím sa eliminuje potreba ďalších externých hadičiek, čerpadiel, pohonov a aktívnych ventilov.Stručne povedané, jediný spôsob ovládania zjednodušuje obsluhu.Sily pôsobiace na kvapalinu v rovnakom mikrofluidnom kanáli v rovnakej vzdialenosti od ťažiska zaťaženia sú rovnaké, čo umožňuje opakovať štruktúru kanála.Zariadenie LOAD je teda jednoduchšie a hospodárnejšie na navrhovanie a výrobu ako bežné zariadenia LOCC, pričom reakcie sú do značnej miery nezávislé a paralelné;avšak kvôli vysokej mechanickej pevnosti odstredivého zariadenia je dostupný materiál triesok obmedzený a malé objemy sú náročné.do auta.Zároveň je väčšina zariadení LOAD navrhnutá len na jedno použitie, čo je drahé na detekciu vo veľkom meradle [96, 117, 118, 119].
V posledných desaťročiach LOAD, považovaný za jedno z najsľubnejších mikrofluidných zariadení, získal značnú pozornosť výskumníkov a výrobcov.LOAD teda získal široké uznanie a používa sa na molekulárnu diagnostiku infekčných patogénov [120, 121, 122, 123, 124], najmä počas prepuknutia COVID-19.Napríklad na konci roka 2020 Ji a spol.[60] demonštrovali priamy test RT-qPCR na rýchlu a automatizovanú paralelnú detekciu SARS-CoV-2 a infekcií chrípkou A a B vo vzorkách výterov z hrdla.Potom Xiong a spol.[74] predstavili diskoidnú mikrofluidnú platformu integrovanú do LAMP na rýchlu, presnú a súčasnú detekciu siedmich ľudských respiračných koronavírusov, vrátane SARS-CoV-2, do 40 minút.Začiatkom roku 2021 de Oliveira a spol.[73] demonštrovali polystyrénový tonerový odstredivý mikrofluidný čip, manuálne ovládaný rotátorom na končeky prstov, na molekulárnu diagnostiku COVID-19 pomocou RT-LAMP.Následne Dignan a spol.[39] prezentovali automatizované prenosné centrifúgové mikrozariadenie na purifikáciu SARS-CoV-2 RNA priamo z bukálnych výterov.Medved a kol.[53] navrhli inline systém odberu vzoriek aerosólov SARS-CoV-2 s malým objemom rotujúceho mikrofluidného fluorescenčného čipu s detekčným limitom 10 kópií/μl a minimálnym prahom cyklu 15 minút.Suarez a kol.[75] nedávno informovali o vývoji integrovanej modulárnej odstredivej mikrofluidnej platformy na priamu detekciu SARS-CoV-2 RNA vo vzorkách tepelne inaktivovaných nazofaryngeálnych výterov pomocou LAMP.Tieto príklady demonštrujú veľké výhody a prísľub LOAD v molekulárnej diagnostike COVID-19.
V roku 1945 Muller a Clegg [125] prvýkrát predstavili mikrofluidné kanály na papieri s použitím filtračného papiera a parafínu.V roku 2007 skupina Whitesides [126] vytvorila prvú funkčnú papierovú platformu na testovanie bielkovín a glukózy.Papier sa stal ideálnym substrátom pre mikrofluidiku.Papier má vlastné vlastnosti, ako je hydrofilnosť a porézna štruktúra, vynikajúca biokompatibilita, nízka hmotnosť, flexibilita, skladateľnosť, nízka cena, jednoduché použitie a pohodlie.Klasické µPAD pozostávajú z hydrofilných/hydrofóbnych štruktúr postavených na papierových substrátoch.V závislosti od trojrozmernej štruktúry možno μPAD rozdeliť na dvojrozmerné (2D) a trojrozmerné (3D) μPAD.2D μPAD sa vyrábajú vytvorením hydrofóbnych hraníc na vytvorenie mikrofluidných kanálov, zatiaľ čo 3D μPAD sa zvyčajne vyrábajú zo stohu vrstiev 2D mikrofluidného papiera, niekedy skladaním papiera, klznými technikami, otvorenými kanálmi a 3D tlačou [96].Vodné alebo biologické tekutiny na μPAD sú primárne riadené kapilárnou silou bez externého zdroja energie, čo uľahčuje predbežné skladovanie činidiel, manipuláciu so vzorkami a multiplexnú detekciu.Presnú kontrolu prietoku a multiplexnú detekciu však brzdí nedostatočná rýchlosť detekcie, citlivosť a opätovná použiteľnosť [96, 127, 128, 129, 130].
Ako nezvyčajná mikrofluidná platforma bol μPAD široko propagovaný a vyvinutý na molekulárnu diagnostiku infekčných chorôb, ako sú HCV, HIV a SARS-CoV-2 [131, 132].Pre selektívnu a citlivú detekciu HCV Tengam et al.[133] vyvinuli nový biosenzor založený na fluorescenčnom papieri s použitím vysoko špecifickej sondy nukleovej kyseliny na báze pyrolidinylpeptidu.Nukleové kyseliny sú kovalentne imobilizované na čiastočne oxidovanom celulózovom papieri redukčnou alkyláciou medzi aminoskupinami a aldehydovými skupinami a detekcia je založená na fluorescencii.Tieto signály dokáže čítať špeciálne vyrobený prístroj s prenosnou fluorescenčnou kamerou v kombinácii s kamerou mobilného telefónu.Následne Lu a spol.[134] navrhli flexibilnú elektródu na papierovej báze na báze nanočastíc niklu/zlata/uhlíkových nanorúriek/polyvinylalkoholových organokovových kompozitných štruktúr na detekciu cieľa HIV hybridizáciou DNA s použitím metylénovej modrej ako redoxného indikátora DNA.Nedávno Chowdury a kol.[135] predstavili návrh hypotetickej platformy na testovanie µPAD na mieste starostlivosti pomocou surových slín pacienta v kombinácii s LAMP a prenosnou zobrazovacou technológiou na detekciu analytu COVID-19.
Skúšky laterálneho prietoku vedú tekutiny kapilárnymi silami a riadia pohyb tekutiny zmáčavosťou a charakteristikami poréznych alebo mikroštruktúrovaných substrátov.Zariadenia s laterálnym prietokom pozostávajú zo vzorky, konjugátu, inkubátora a detekcie a absorpčných vankúšikov.Molekuly nukleovej kyseliny v LFA rozpoznávajú špecifické väzbové látky, ktoré sú vopred uložené vo väzbovom mieste a viažu sa ako komplexy.Keď kvapalina prechádza cez inkubačné a detekčné platne, komplexy sú zachytené záchytnými molekulami umiestnenými na testovacej a kontrolnej čiare, čo ukazuje výsledky, ktoré je možné odčítať priamo voľným okom.LFA je zvyčajne možné dokončiť za 2 až 15 minút, čo je rýchlejšie ako tradičné objavovanie.Vďaka špeciálnemu mechanizmu si LFA vyžaduje málo operácií a nevyžaduje ďalšie vybavenie, vďaka čomu je veľmi užívateľsky prívetivý.Ľahko sa vyrába a miniaturizuje a náklady na papierové substráty sú nižšie.Používa sa však iba na kvalitatívnu analýzu a kvantitatívna detekcia je veľmi ťažká a schopnosť multiplexovania a priepustnosť sú veľmi obmedzené a súčasne je možné detegovať iba jednu dostatočnú nukleovú kyselinu [96, 110, 127].
Hoci väčšina aplikácií LFA je zameraná na imunotesty, efektívne a obľúbené je aj použitie LFA na molekulárnu diagnostiku v mikrofluidných čipoch [136].V prípade vírusu hepatitídy B, HIV a SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] navrhli platformu LFA s nanočasticovou konverziou a preukázali všestrannosť tejto miniaturizovanej a prenosnej platformy prostredníctvom citlivej a kvantitatívnej detekcie viacerých cieľov, ako je napríklad nukleová kyselina HBV.Okrem toho Fu a kol.[138] demonštrovali novú LFA založenú na Ramanovej spektroskopii s vylepšeným povrchom na kvantitatívnu analýzu DNA HIV-1 pri nízkych koncentráciách.Pre rýchlu a citlivú detekciu SARS-CoV-2 Liu et al.[85] vyvinuli mikrofluidnú integrovanú RPA analýzu laterálneho toku kombináciou RT-RPA a univerzálneho systému detekcie laterálneho toku do jedného mikrofluidného systému.
Aplikácia rôznych mikrofluidných platforiem sa líši v závislosti od konkrétnych štúdií, pričom sa naplno využívajú možnosti a výhody platforiem.S cenovo dostupnými ventilmi, čerpadlami a potrubím je LOCC najkomplexnejšou platformou pre rozmanitosť aplikácií a interoperabilitu s najväčším priestorom pre vývoj.Preto dúfame a odporúčame, aby sa najnovšie štúdie vykonali na LOCC ako prvý pokus a aby sa podmienky optimalizovali.Okrem toho sa očakáva, že sa v systéme objavia a použijú efektívnejšie a presnejšie metódy.LOAD vyniká presnou kontrolou tekutín z existujúcich zariadení LOCC a demonštruje jedinečné výhody v jednotlivých pohonoch pomocou odstredivej sily bez potreby externých pohonov, pričom paralelné odozvy môžu byť oddelené a synchronizované.V budúcnosti sa tak LOAD stane hlavnou mikrofluidnou platformou s menším počtom manuálnych operácií a vyspelejšími a automatizovanými technológiami.Platforma µPAD kombinuje výhody LOCC a papierových materiálov pre nízkonákladovú diagnostiku na jedno použitie.Budúci vývoj by sa preto mal zamerať na pohodlné a dobre zavedené technológie.Okrem toho sa LFA dobre hodí na detekciu voľným okom, čo sľubuje zníženie spotreby vzorky a zrýchlenie detekcie.Podrobné porovnanie platforiem je uvedené v tabuľke 2.
Digitálne analýzy rozdeľujú vzorku do mnohých mikroreaktorov, z ktorých každý obsahuje diskrétny počet cieľových molekúl [139, 140].Digitálne testy ponúkajú významné výhody pri vykonávaní absolútnej kvantifikácie vykonávaním tisícok paralelných biochemických experimentov súčasne a jednotlivo v kompartmentoch v mikrónovom meradle, a nie v kontinuálnej fáze.V porovnaní s tradičnou mikrofluidikou môžu kompartmentové reakcie znížiť objem vzorky, zvýšiť efektivitu reakcie a môžu byť jednoducho integrované s inými analytickými metódami bez potreby kanálov, čerpadiel, ventilov a kompaktných dizajnov [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Nasledujúce dve metódy sa používajú v digitálnych testoch na dosiahnutie rovnomernej a presnej separácie roztokov, vrátane činidiel a vzoriek, ako sú bunky, nukleové kyseliny a iné častice alebo molekuly: (1) kvapkové emulzie využívajúce nestabilitu kvapalného rozhrania;(2) delenie poľa sa vykonáva pomocou geometrických obmedzení zariadenia.V prvej metóde môžu byť kvapôčky obsahujúce činidlá a vzorky v mikrokanálikoch vytvorené pasívnymi metódami, ako je súprúd, krížový tok, fokusácia toku, stupňovitá emulgácia, mikrokanálová emulgácia a membrány prostredníctvom viskóznych šmykových síl a emulgácie so zmenou kanála.lokalizácia [143, 145, 146, 148, 149] alebo pomocou aktívnych metód [150, 151], ktoré zavádzajú dodatočnú energiu prostredníctvom elektrického, magnetického, tepelného a mechanického riadenia.V druhom prístupe je najlepšia rovnomernosť objemu tekutiny v mikrofluidných komorách zdieľaná udržiavaním priestorových štruktúr rovnakej veľkosti, ako sú mikrojamky a povrchové polia [152, 153, 154].Najmä kvapôčky sú hlavnými prietokovými sekciami, ktoré je možné generovať a manipulovať s nimi na elektródových poliach založených na digitálnej mikrofluidike (DMF).Elektrozmáčanie dielektrika je jednou z najlepšie študovaných teórií DMF, pretože elektrozmáčanie dielektrika umožňuje presnú manipuláciu s jednotlivými kvapkami, riadenie tvaru kvapaliny a asymetrické elektrické signály prechádzajúce rôznymi stranami [141, 144].Medzi hlavné operácie s kvapôčkami v DMF patrí triedenie, štiepenie a zlučovanie [151, 155, 156], ktoré možno použiť v rôznych oblastiach analýzy, najmä pri molekulárnej detekcii [157, 158, 159].
Digitálna detekcia nukleových kyselín je molekulárna diagnostická technológia tretej generácie po konvenčnej PCR a kvantitatívnej PCR v reálnom čase (qPCR), paralelne s vysokovýkonným sekvenovaním a tekutou biopsiou.V posledných dvoch desaťročiach sa digitálne nukleové kyseliny rýchlo rozvinuli v oblasti molekulárnej diagnostiky infekčných patogénov [160, 161, 162].Absolútna kvantifikácia digitálnej detekcie nukleových kyselín začína balením vzoriek a činidiel do jednotlivých kompartmentov, aby sa zabezpečilo, že každá cieľová sekvencia má rovnakú pravdepodobnosť vstupu do každého jednotlivého kompartmentu.Teoreticky môže byť každej sekcii priradených viacero cieľových sekvencií alebo nemusí existovať nezávislý mikroreakčný systém.Prostredníctvom rôznych snímacích mechanizmov opísaných vyššie, kompartmenty s mikrobiálnymi cieľovými sekvenciami, ktoré generujú signály nad určitým prahom, môžu byť vizualizované voľným okom alebo strojom a sú označené ako pozitívne, zatiaľ čo iné kompartmenty, ktoré generujú signály pod prahom, sú označené ako pozitívne. .záporné, vďaka ktorým je signál pre každú sekciu boolovský.Výpočtom počtu vytvorených kompartmentov a miery pozitívnych výsledkov po reakcii je možné porovnať pôvodné kópie testovacích vzoriek pomocou Poissonovho distribučného vzorca bez potreby štandardnej krivky, ktorá je potrebná pre rutinné kvantitatívne analýzy, napr. ako qPCR.[163] V porovnaní s tradičnými molekulárnymi diagnostickými metódami má digitálna detekcia nukleových kyselín vyšší stupeň automatizácie, vyššiu rýchlosť a citlivosť analýzy, menej činidiel, menšiu kontamináciu a jednoduchší dizajn a výrobu.Z týchto dôvodov bolo počas kritického prepuknutia SARS-CoV-2 dobre študované používanie digitálnych testov, najmä metód založených na kvapkách, na molekulárnu diagnostiku, ktoré kombinujú techniky amplifikácie a čítania signálu.Napríklad Yin a kol.[164] kombinovali kvapôčkovú digitálnu a rýchlu PCR metódy na detekciu génov ORF1ab, N a RNázy P v SARS-CoV-2 v mikrofluidnom čipe.Je pozoruhodné, že systém bol schopný identifikovať pozitívny signál do 115 sekúnd, čo je rýchlejšie ako konvenčná PCR, čo naznačuje jeho účinnosť pri detekcii v mieste starostlivosti (obrázok 7a).Dong a spol.[165], Sow a kol.[157], Chen a kol.[166] a Alteri a kol.[167] tiež použili kvapôčkovú digitálnu PCR (ddPCR) na detekciu SARS-CoV-2 v mikrofluidnom systéme s pôsobivými výsledkami.Na ďalšie zlepšenie miery detekcie Shen a kol.[168] dosiahli čipové zobrazovanie založené na ddPCR už za 15 s bez použitia techník spájania obrázkov, čím sa zrýchlil proces technológie ddPCR z laboratória do aplikácie.Používajú sa nielen metódy tepelnej amplifikácie ako je PCR, ale na zjednodušenie reakčných podmienok a rýchlej odozvy sa používajú aj metódy izotermickej amplifikácie.Lu a spol.[71] vyvinuli SlipChip na analýzu kvapôčok, schopný generovať kvapôčky rôznych veľkostí pri vysokých hustotách v jednom kroku a kvantifikovať nukleové kyseliny SARS-CoV-2 pomocou digitálnej LAMP (obrázok 7b).Ako rýchlo sa vyvíjajúca technológia môže CRISPR tiež hrať dôležitú úlohu pri digitálnej detekcii nukleových kyselín prostredníctvom pohodlného kolorimetrického zobrazovania bez potreby ďalších farbív nukleových kyselín.Ackerman a kol.vyvinuli kombinačnú matricovú reakciu na multiplexné hodnotenie nukleových kyselín.[158] detegovali 169 vírusov spojených s človekom, vrátane SARS-CoV-2, v kvapkách obsahujúcich činidlá na detekciu nukleových kyselín na báze CRISPR-Cas13 v mikrojamkovom teste (obrázok 7c).Okrem toho možno v rovnakom systéme použiť izotermické zosilnenie a technológiu CRISPR, aby sa spojili výhody oboch.Park a kol.[169] Digitálny test CRISPR/Cas12a bol vyvinutý v komerčnom mikrofluidnom čipe na detekciu extrahovaného a teplom usmrteného SARS-CoV-2 na základe jednostupňového RT-RPA s kratšou a vyššou detekciou signálu na pozadí časový pomer., širší dynamický rozsah a lepšia citlivosť (obr. 7d).Niektoré opisy týchto príkladov sú uvedené v tabuľke 3.
Typická digitálna platforma na detekciu nukleových kyselín.a Rýchly digitálny pracovný postup PCR pozostáva zo štyroch kľúčových krokov: príprava vzorky, distribúcia reakčnej zmesi, proces amplifikácie a cieľová kvantifikácia (upravené podľa [164]).b Schéma znázorňujúca analýzu kvapiek SlipChip na tvorbu kvapiek pri vysokej hustote (upravené z [71]).c Diagram pracovného toku CARMEN-Cas13 (upravené z [158]).d Prehľad pokročilej digitálnej detekcie vírusov pomocou CRISPR/Cas v jednom hrnci (upravené z [169]).W/O voda v oleji, polydimetylsiloxán PDMS, PCR polymerázová reťazová reakcia, zber údajov DAQ, proporcionálny integrálny derivát PID, kombinatorická matricová reakcia CARMEN na vyhodnotenie multiplexných nukleových kyselín, SARS-CoV-2, ťažký akútny respiračný syndróm, koronavírus 2 , RT Amplifikácia reverznej transkriptázy rekombináza polymeráza-RPA, signál S/B v pozadí
Čas odoslania: 15. september 2022
