Správy

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Metódy enzymatického značenia blízkosti založené na aktivovaných esteroch alebo fenoxy radikáloch sa široko používajú na mapovanie subcelulárnych proteómov a proteínových interaktorov v živých bunkách.Aktivované estery sú však menej reaktívne, čo má za následok široký rádius značenia a fenoxy radikály generované peroxidom môžu interferovať s redoxnými dráhami.Tu uvádzame metódu fotoaktivácie závislej od značenia blízkosti (PDPL) vyvinutú genetickým spojením miniSOG fotosenzibilizačného proteínu s požadovaným proteínom.Spúšťaním modrým svetlom a riadeným časom expozície sa generuje singletový kyslík a potom sa dosiahne časovo rozlíšené značenie histidínových zvyškov anilínovou sondou.Preukazujeme jeho vysokú vernosť prostredníctvom mapovania proteómu špecifického pre organely.Porovnanie PDPL vedľa seba s TurboID ukazuje konkrétnejšie a komplexnejšie proteomické pokrytie PDPL.Ďalej sme aplikovali PDPL na transkripčný koaktivátor BRD4 a E3 Parkin ligázu spojený s ochorením a našli sme predtým neznáme interakcie.Skríningom nadmernej expresie boli identifikované dva neznáme substráty, Ssu72 a SNW1, pre Parkin, ktorého degradácia je sprostredkovaná ubikvitináciou-proteazómovou dráhou.
Presná charakterizácia proteínových sietí je základom mnohých základných bunkových procesov.Preto vysoko presné časopriestorové mapovanie proteínových interakcií poskytne molekulárny základ na dešifrovanie biologických dráh, patológiu chorôb a narušenie týchto interakcií na terapeutické účely.Na tento účel sú veľmi žiaduce metódy schopné detegovať časové interakcie v živých bunkách alebo tkanivách.Afinitná purifikačná hmotnostná spektrometria (AP-MS) sa historicky používala na identifikáciu väzbových partnerov záujmových proteínov (POI).S rozvojom kvantitatívnych proteomických metód vznikla Bioplex3.0, najväčšia databáza proteínových sietí na báze AP-MS.Aj keď je AP-MS veľmi silný, kroky lýzy a riedenia buniek v pracovnom postupe sú orientované na slabé a prechodné väzbové interakcie a zavádzajú artefakty po lýze, ako sú falošné interakcie, ktorým pred lýzou chýba kompartmentalizácia.
Na vyriešenie týchto problémov boli vyvinuté neprirodzené aminokyseliny (UAA) so zosieťovacími skupinami a platformy enzymatického blízkeho značenia (PL) (napr. APEX a BioID)5.Hoci metóda UAA bola úspešne aplikovaná v mnohých scenároch a poskytuje informácie o priamych proteínových lepidlách, stále je potrebná optimalizácia miesta inzercie UAA.Ešte dôležitejšie je, že ide o stechiometrickú metódu označovania, ktorej chýba katalytické zvrátenie udalostí označovania.Na rozdiel od toho enzymatické metódy PL, ako je metóda BioID, fúzujú upravenú biotín ligázu s POI7, ktorá následne aktivuje biotín za vzniku reaktívneho biotinyl-AMP esterového medziproduktu.Enzým tak katalyzuje a uvoľňuje aktivovaný biotínový „oblak“, ktorý označuje proximálne lyzínové zvyšky.BioID však vyžaduje viac ako 12 hodín na získanie dostatočne označeného signálu, čo vylučuje jeho použitie s časovým rozlíšením.Použitím riadenej evolúcie založenej na kvasinkovom displeji bol TurboID navrhnutý na základe BioID tak, aby bol efektívnejší a umožnil efektívne značenie biotínom do 10 minút, čo umožnilo študovať dynamickejšie procesy.Pretože TurboID je vysoko aktívny a hladiny endogénneho biotínu sú dostatočné na značenie na nízkej úrovni, značenie na pozadí sa stáva potenciálnym problémom, keď sa vyžaduje vysoko zosilnené a načasované značenie pridaním exogénneho biotínu.Okrem toho sú aktivované estery slabo reaktívne (t1/2 ~5 min), čo môže viesť k veľkému rádiusu značenia, najmä po nasýtení susedných proteínov biotínom 5. V inom prístupe je genetická fúzia umelo upravenej askorbátperoxidázy (tj biotín- fenolové radikály a umožňuje značenie proteínov do jednej minúty9,10 APEX sa široko používa na identifikáciu subcelulárnych proteómov, komplexov membránových proteínov a cytosolických signálnych proteínových komplexov.11,12 Potreba vysokých koncentrácií peroxidov však môže ovplyvniť redox proteíny alebo dráhy, narušiť bunkové procesy.
Dôležitým doplnkom k existujúcim metódam bude teda nová metóda schopná generovať reaktívnejšie druhy supresie značeného polomeru s vysokou priestorovou a časovou presnosťou bez výrazného narušenia bunkových dráh. Spomedzi reaktívnych druhov vzbudil našu pozornosť singletový kyslík pre svoju krátku životnosť a obmedzený polomer difúzie (t1/2 < 0,6 µs v bunkách)13. Spomedzi reaktívnych druhov vzbudil našu pozornosť singletový kyslík pre svoju krátku životnosť a obmedzený polomer difúzie (t1/2 < 0,6 µs v bunkách)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Spomedzi aktívnych foriem nás zaujal singletový kyslík pre svoju krátku životnosť a obmedzený polomer difúzie (t1/2 < 0,6 µs v bunkách)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 μs／躚巕䨕 伏 サ 䨕 ＄ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Spomedzi aktívnych foriem priťahuje našu pozornosť singletový kyslík pre svoju krátku životnosť a obmedzený polomer difúzie (t1/2 < 0,6 μs v bunkách).Uvádza sa, že singletový kyslík náhodne oxiduje metionín, tyrozín, histidín a tryptofán, vďaka čomu je polárny 14,15 na pripojenie k sondám na báze amínu alebo tiolu16,17.Hoci singletový kyslík bol použitý na značenie subcelulárnej kompartmentovej RNA, stratégie na opätovné použitie endogénnych markerov blízkosti POI zostávajú nepreskúmané.Tu uvádzame platformu nazývanú značenie blízkosti závislé od fotoaktivácie (PDPL), kde používame modré svetlo na osvetlenie POI spojených s fotosenzibilizátorom miniSOG a spúšťanie tvorby singletového kyslíka na oxidáciu proximálnych zvyškov, po ktorej nasledujú modifikácie obsahujúce amín na oxidáciu chemických sond do stredné živé bunky..Testovali sme skupinu chemických sond, aby sme maximalizovali špecificitu značky a identifikovali sme modifikačné miesta pomocou otvoreného proteomického pracovného postupu.Porovnanie PDPL vedľa seba s TurboID ukazuje konkrétnejšie a komplexnejšie proteomické pokrytie PDPL.Tento prístup sme aplikovali na organely špecifické markery subcelulárneho proteómu a všeobecnú proteómovú identifikáciu väzobných partnerov pre epigenetický regulačný proteín BRD4 spojený s rakovinou a E3 ligázu Parkin súvisiacu s Parkinsonovou chorobou, čo potvrdilo známu aj neznámu sieť proteínov. interakcie..Schopnosť PDPL rozpoznávať E3 substráty vo veľkých proteínových komplexoch predstavuje situáciu, kedy je potrebné rozpoznanie nepriamych väzbových látok.In situ boli potvrdené dva neznáme parkínové substráty sprostredkované ubikvitinačným proteazómom.
Fotodynamická terapia (PDT)19 a chromoforom asistovaná laserová inaktivácia (CALI)20, pri ktorej ožarovanie svetlom fotosenzibilizátormi generuje singletový kyslík, môže inaktivovať cieľové proteíny alebo spôsobiť bunkovú smrť.Keďže singletový kyslík je vysoko reaktívna látka s teoretickou difúznou vzdialenosťou približne 70 nm, možno regulovať priestorovo obmedzenú oxidáciu okolo fotosenzibilizátora.Na základe tohto konceptu sme sa rozhodli použiť singletový kyslík na dosiahnutie presného značenia proteínových komplexov v živých bunkách.Vyvinuli sme PDPL chemoproteomický prístup na splnenie štyroch funkcií: (1) katalyzovať tvorbu aktívneho singletového kyslíka podobne ako PL enzymatický prístup;(2) poskytnúť časovo rozlíšené označenie pri iniciácii svetla;(3) zmenou (4) Vyhnite sa používaniu endogénnych kofaktorov (ako je biotín) na zníženie pozadia, alebo používajte vysoko rušivé exogénne činidlá (ako sú peroxidy), aby ste minimalizovali vystavenie buniek environmentálnemu stresu.
Fotosenzibilizátory možno rozdeliť do dvoch kategórií vrátane fluoroforov s nízkou molekulovou hmotnosťou (napr. bengálska ruža, metylénová modrá)22 a geneticky kódovaných malých proteínov (napr. miniSOG, KillerRed)23.Aby sme dosiahli modulárny dizajn, vyvinuli sme platformu PDPL prvej generácie pridaním proteínov fotosenzibilizátora (PS) do POI24,25 (obrázok 1a).Keď je singletový kyslík ožiarený modrým svetlom, oxiduje proximálne nukleofilné aminokyselinové zvyšky, čo vedie k umpolungovej polarite, ktorá je elektrofilná a môže ďalej reagovať s nukleofilmi amínovej sondy16,17.Sonda je navrhnutá s alkínovou rukoväťou, ktorá umožňuje chémiu kliknutia a ťahanie nadol pre charakterizáciu LC/MS/MS.
Schematické znázornenie značenia proteínových komplexov sprostredkované miniSOG.Keď sú vystavené modrému svetlu, bunky exprimujúce miniSOG-POI generujú singletový kyslík, ktorý modifikuje interagujúce proteíny, ale nie neväzbové proteíny.Medziprodukty fotooxidácie sú zachytené reléovými značkami amínovej chemickej sondy za vzniku kovalentných aduktov.Alkinylová skupina na chemickej sonde umožňuje chémiu kliknutia na obohatenie stiahnutím nadol, po ktorom nasleduje kvantifikácia LC-MS/MS.b Chemická štruktúra amínových sond 1-4.c Reprezentatívna fluorescenčná gélová analýza mitochondriálne lokalizovaných miniSOG-sprostredkovaných proteomických markerov pomocou sond 1-4 a relatívnej kvantifikácie založenej na gélovej denzitometrii.Pomer signálu k pozadiu chemických sond sa hodnotil pomocou negatívnych kontrolných experimentov s výnimkou modrého svetla alebo s použitím buniek HEK293T bez expresie miniSOG.n = 2 biologicky nezávislé vzorky.Každá bodka predstavuje biologickú repliku.d Reprezentatívna detekcia a kvantifikácia PDPL pomocou optimalizovanej sondy 3 v prítomnosti alebo neprítomnosti uvedených zložiek PDPL, ako je c.n = 3 biologicky nezávislé vzorky.Každá bodka predstavuje biologickú repliku.Stredové čiary a fúzy predstavujú priemer a ± štandardnú odchýlku.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokálne zobrazenie singletového kyslíka s ďaleko červeným Si-DMA farbením.Mierka: 10 µm.Gélové zobrazovacie a konfokálne experimenty sa nezávisle opakovali aspoň dvakrát s podobnými výsledkami.
Najprv sme testovali schopnosť zrelých fotosenzibilizátorov miniSOG26 a KillerRed23, stabilne exprimovaných v HEK293T, sprostredkovať propargylamínové značenie proteómu ako chemickú sondu (doplnkový obrázok 1a).Gélová fluorescenčná analýza ukázala, že značenie celého proteómu sa dosiahlo pomocou miniSOG a ožarovania modrým svetlom, zatiaľ čo pri KillerRed nebol pozorovaný žiadny viditeľný značiaci produkt.Na zlepšenie pomeru signálu k pozadiu sme potom testovali sadu chemických sond obsahujúcich anilín (1 a 3), propylamín (2) alebo benzylamín (4).Pozorovali sme, že samotné bunky HEK293T mali vyšší signál pozadia v porovnaní so žiadnym modrým svetlom, pravdepodobne v dôsledku endogénneho riboflavínového fotosenzibilizátora, flavínmononukleotidu (FMN)27. Chemické sondy 1 a 3 na báze anilínu poskytli lepšiu špecifickosť, pričom HEK293T stabilne exprimuje miniSOG v mitochondriách a vykazuje > 8-násobný nárast signálu pre sondu 3, zatiaľ čo sonda 2 použitá v metóde značenia RNA CAP-seq zobrazuje iba ~2,5- násobné zvýšenie signálu, pravdepodobne v dôsledku rôznych preferencií reaktivity medzi RNA a proteínom (obr. 1b, c). Chemické sondy 1 a 3 na báze anilínu poskytli lepšiu špecifickosť, pričom HEK293T stabilne exprimuje miniSOG v mitochondriách a vykazuje > 8-násobný nárast signálu pre sondu 3, zatiaľ čo sonda 2 použitá v metóde značenia RNA CAP-seq zobrazuje iba ~2,5- násobné zvýšenie signálu, pravdepodobne v dôsledku rôznych preferencií reaktivity medzi RNA a proteínom (obr. 1b, c).Chemické sondy 1 a 3 na báze anilínu vykazovali lepšiu špecifickosť: HEK293T, ktorý stabilne exprimuje miniSOG v mitochondriách, vykazuje viac ako 8-násobné zvýšenie signálu pre sondu 3, zatiaľ čo sonda 2, používaná v metóde značenia RNA CAP-seq, iba ukazuje ~2,5-násobné zvýšenie signálu, pravdepodobne v dôsledku rôznych preferencií reaktivity medzi RNA a proteínom (obr. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 特异性 ， ， Hek293T 在 线 粒体 稳定 表达 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 2,5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAChemické sondy 1 a 3 na báze anilínu mali lepšiu špecifickosť, HEK293T stabilne exprimoval miniSOG v mitochondriách a sonda 3 mala viac ako 8-násobný nárast signálu, zatiaľ čo sonda 2 pre metódu značenia CAP-seq RNA vykazovala iba ~2,5-násobné zvýšenie.v signáli, pravdepodobne v dôsledku odlišných preferencií reakcie medzi RNA a proteínom (obr. 1b, c).Okrem toho sa testovali izoméry sondy 3 a hydrazínové sondy (sondy 5, 6, 7), čo potvrdilo optimalizáciu sondy 3 (doplnkový obrázok 1b, c).Podobne fluorescenčná analýza v géli odhalila ďalšie optimalizované experimentálne parametre: vlnová dĺžka ožiarenia (460 nm), koncentrácia chemickej sondy (1 mM) a doba ožarovania (20 minút) (doplnkový obrázok 2a–c).Vynechanie akéhokoľvek komponentu alebo kroku v protokole PDPL malo za následok výrazné zvrátenie signálu na pozadie (obr. 1d).Je pozoruhodné, že značenie proteínov sa výrazne znížilo v prítomnosti azidu sodného alebo troloxu, o ktorých je známe, že potláčajú singletový kyslík.Prítomnosť D2O, o ktorom je známe, že stabilizuje singletový kyslík, zvyšuje signál značenia.Na preskúmanie príspevku iných reaktívnych foriem kyslíka k značeniu sa pridali manitol a vitamín C, aby sa vytvorili lapače hydroxylových a superoxidových radikálov, 18, 29, ale nezistilo sa, že by redukovali značenie.Pridanie H2O2, ale nie osvetlenie, neviedlo k značeniu (doplnkový obrázok 3a).Zobrazovanie fluorescenčného singletového kyslíka pomocou Si-DMA sond potvrdilo prítomnosť singletového kyslíka v drôte HEK293T-miniSOG, ale nie v pôvodnom drôte HEK293T.Okrem toho mitoSOX Red nedokázal po osvetlení detekovať produkciu superoxidu (obr. 1e a doplnkový obrázok 3b) 30. Tieto údaje silne naznačujú, že singletový kyslík je hlavnou reaktívnou formou kyslíka zodpovednou za následné proteomické značenie.Cytotoxicita PDPL sa hodnotila vrátane ožarovania modrým svetlom a chemických sond a nepozorovala sa žiadna významná cytotoxicita (doplnkový obrázok 4a).
Aby sme mohli študovať mechanizmus značenia a umožniť proteomickú identifikáciu proteínových komplexov pomocou LC-MS/MS, musíme najprv určiť, ktoré aminokyseliny sú modifikované, a delta hmotnosť značiek sond.Uvádza sa, že metionín, histidín, tryptofán a tyrozín sú modifikované singletovým kyslíkom14,15.Integrujeme pracovný postup TOP-ABPP31 s nezaujatým otvoreným vyhľadávaním poskytovaným výpočtovou platformou FragPipe založenou na MSFragger32.Po modifikácii singletového kyslíka a chemickom značení sondy sa uskutočnila click chémia s použitím biotínovej redukčnej značky obsahujúcej štiepiteľný linker, po čom nasledovalo napínanie neutravidínom a štiepenie trypsínom.Modifikovaný peptid, stále naviazaný na živicu, sa fotoštiepil na analýzu LC-MS/MS (obrázok 2a a doplnkové údaje 1).V celom proteóme sa vyskytlo veľké množstvo modifikácií, pričom bolo uvedených viac ako 50 zhôd s peptidovou mapou (PSM) (obr. 2b).Prekvapivo sme pozorovali iba modifikáciu histidínu, pravdepodobne v dôsledku vyššej reaktivity oxidovaného histidínu voči anilínovým sondám ako iné aminokyseliny.Podľa publikovaného mechanizmu oxidácie histidínu singletovým kyslíkom21,33 navrhovaná delta-hmotnostná štruktúra +229 Da zodpovedá aduktu sondy 3 s 2-oxo-histidínom po dvoch oxidáciách, pričom +247 Da je produkt hydrolýzy +229 Da (doplnkový obrázok 5).Vyhodnotenie spektra MS2 ukázalo vysokú spoľahlivosť identifikácie väčšiny iónov y a b, vrátane identifikácie modifikovaných fragmentových iónov (y a b) (obr. 2c).Kontextová analýza lokálnej sekvencie histidínov modifikovaných PDPL odhalila miernu motívovú preferenciu pre malé hydrofóbne zvyšky v polohách ± 1 (doplnkový obrázok 4b).V priemere sa identifikovalo 1, 4 histidínov na proteín a miesta týchto markerov sa určili analýzou povrchovej plochy dostupnej pre rozpúšťadlo (SASA) a relatívnej dostupnosti rozpúšťadla (RSA) (doplnkový obrázok 4c, d).
Nezaujatý pracovný postup na štúdium zvyškovej selektivity pomocou výpočtovej platformy FragPipe poháňanej spoločnosťou MSFragger.Štiepiteľné linkery sa používajú v Click chémii na umožnenie fotoštiepenia modifikovaných peptidov zo streptavidínovej živice.Bolo spustené otvorené vyhľadávanie s cieľom identifikovať početné modifikácie, ako aj relevantné pozostatky.b Priraďte množstvo modifikácií vyskytujúcich sa v proteóme.Peptidové mapovanie PSM.c MS2 spektrálna anotácia histidínových miest modifikovaných sondou 3. Ako reprezentatívny príklad kovalentná reakcia so sondou 3 pridala +229,0938 Da k modifikovanej aminokyseline.d Mutačný test používaný na testovanie markerov PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) a PRDX1 (H10A, H81A, H169A) boli transfekované plazmidmi divokého typu na detekciu anti-Flag.e Syntetický peptid reagoval s purifikovaným miniSOG v prítomnosti sondy 3 a zodpovedajúce produkty s AM +247 a +229 boli zaznamenané v LC-MS spektre.f In vitro interakcie proteín-proteín modelované s miniSOG-6xHis-tag a anti-6xHis protilátkou.Antibiotín (streptavidín-HRP) a anti-myšia Western blot analýza komplexov protilátok miniSOG-6xHis/anti-6xHis označených sondou 3, v závislosti od času vystavenia svetlu.Označenia pre jednotlivé proteíny sú vyjadrené v zodpovedajúcej molekulovej hmotnosti: ľahký reťazec protilátky LC, ťažký reťazec protilátky HC.Tieto experimenty sa nezávisle opakovali aspoň dvakrát s podobnými výsledkami.
Na biochemické overenie miesta značenia sa PRDX3 a PRDX1 identifikované hmotnostnou spektrometriou zmenili z histidínu na alanín a v transfekčných testoch sa porovnali s divokým typom.Výsledky PDPL ukázali, že mutácia významne znížila značenie (obr. 2d).Medzitým sa syntetizovali peptidové sekvencie identifikované v otvorenom vyhľadávaní a reagovali in vitro s purifikovaným miniSOG v prítomnosti sondy 3 a modrého svetla, čím sa získali produkty s hmotnostným posunom +247 a +229 Da, keď boli detegované pomocou LC-MS (obr. 2e).).Aby sme otestovali, či interagujúce proximálne proteíny môžu byť označené in vitro v reakcii na fotoaktiváciu miniSOG, navrhli sme test umelej blízkosti interakciou medzi proteínom miniSOG-6xHis a anti-His monoklonálnou protilátkou in vitro (obrázok 2f).V tomto teste sme očakávali proximálne značenie ťažkých a ľahkých reťazcov protilátky pomocou miniSOG.V skutočnosti, anti-myšie (rozpoznávajúce ťažké a ľahké reťazce anti-6xHis-značenej protilátky) a streptavidín Western bloty ukázali silnú biotinyláciu ťažkých a ľahkých reťazcov.Predovšetkým sme si všimli autobiotinyláciu miniSOG v dôsledku značky 6xHis a krížových väzieb medzi ľahkými a ťažkými reťazcami, čo môže súvisieť s predtým opísanou medzerou medzi lyzínom a proximálnou odpoveďou 2-oxo-histidínu.Na záver sme dospeli k záveru, že PDPL modifikuje histidín spôsobom závislým od blízkosti.
Naším ďalším cieľom bolo charakterizovať subcelulárny proteóm na testovanie špecificity in situ značenia.Preto sme stabilne exprimovali miniSOG v jadre, mitochondriálnej matrici alebo vonkajšej ER membráne buniek HEK293T (obr. 3a).Gélová fluorescenčná analýza odhalila hojné značené pásy na troch subcelulárnych miestach, ako aj rôzne vzory značenia (obr. 3b).Fluorescenčná zobrazovacia analýza ukázala vysokú špecificitu PDPL (obr. 3c).Po pracovnom postupe PDPL nasledovali klikacie reakcie s rodamínovými farbivami na vymedzenie subcelulárnych proteómov pomocou fluorescenčnej mikroskopie a signály PDPL sa kolokalizovali s DAPI, mitochondriálnymi sledovačmi alebo sledovačmi ER, čo potvrdilo vysokú presnosť PDPL.Pokiaľ ide o tri miesta organel, porovnanie PDPL s TurboID vedľa seba pomocou avidínového western blotu ukázalo, že PDPL bol označený špecifickejšie v porovnaní s ich príslušnými kontrolami.V podmienkach PDPL sa objavilo viac značených pásov, čo naznačuje viac proteínov značených PDPL (doplnkový obrázok 6a-d).
Schematické znázornenie značenia proteómu špecifického pre organely sprostredkované miniSOG.miniSOG sa zameriava na mitochondriálnu matricu prostredníctvom fúzie s N-terminálnymi 23 aminokyselinami ľudského COX4 (mito-miniSOG), jadro prostredníctvom fúzie s H2B (nucleus-miniSOG) a Sec61β cez cytoplazmatickú stranu membrány ER (ER-miniSOG ).Indikácie zahŕňajú gélové zobrazenie, konfokálne zobrazenie a hmotnostnú spektrometriu.b Reprezentatívne gélové snímky troch profilov PDPL špecifických pre organely.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentatívne konfokálne obrazy buniek HEK293T stabilne exprimujúcich miniSOG s rôznymi subcelulárnymi lokalizáciami detegovanými protilátkou označenou V5 (červená).Subcelulárne markery sa používajú pre mitochondrie a ER (zelené).Pracovný postup PDPL zahŕňa detekciu miniSOG (žltá) značených subcelulárnych proteómov pomocou Cy3-azidovej cvakacej chémie.Mierka: 10 µm.d Vulkanické grafy proteómov označených PDPL v rôznych organelách kvantifikovaných neznačenou kvantifikáciou (n = 3 nezávislé biologické experimenty).Na pozemkoch sopiek sa použil dvojstranný Studentov t-test.HEK293T divoký typ sa použil ako negatívna kontrola. Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v intenzite iónov). Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v intenzite iónov). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a >2-кратная разнтица вовининина). Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v intenzite iónov).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a > 2-кратная разнициой в ). Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v iónovej sile).Súvisiace proteíny dôležité pre HEK293T-miniSOG, ale nie dôležité pre HEK293T, sú zobrazené zelenou farbou.e Analýza špecifickosti súborov proteomických údajov z experimentov d.Celkový počet štatisticky významných proteínov v každej organele (červené a zelené bodky) je vyznačený v hornej časti.Histogramy ukazujú proteíny lokalizované v organelách na základe MitoCarta 3.0, GO analýzy a A. Tinga a kol.ľudí.Samostatné súbory údajov pre mitochondrie, jadrá a ER.Tieto experimenty sa nezávisle opakovali aspoň dvakrát s podobnými výsledkami.Nespracované údaje sa poskytujú vo forme súborov s nespracovanými údajmi.
Na kvantifikáciu identifikovaného proteómu v každej organele, povzbudená výsledkami gélu a zobrazovania, sa použila kvantifikácia bez označenia (doplnkové údaje 2).Netransfekovaný HEK293T sa použil ako negatívna kontrola na odčítanie markerov pozadia. Analýza sopečného grafu ukázala významne obohatené proteíny (p < 0,05 a > 2-násobok intenzity iónov), ako aj proteíny singleton, ktoré sú prítomné iba v líniách exprimujúcich miniSOG (obr. 3d červené a zelené bodky). Analýza sopečného grafu ukázala významne obohatené proteíny (p < 0,05 a > 2-násobok intenzity iónov), ako aj proteíny singleton, ktoré sú prítomné iba v líniách exprimujúcich miniSOG (obr. 3d červené a zelené bodky). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analýza sopečného grafu ukázala významne obohatené proteíny (p<0,05 a >2-násobok intenzity iónov), ako aj jednotlivé proteíny, ktoré sú prítomné iba v líniách exprimujúcich miniSOG (obr. 3d, červené a zelené bodky).火山图 分析 显示 出 显着 富集 蛋白质 （（p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 在于 在于 Minisog 表达 系 中 单一 蛋白质 （图 图 3D 红色 和）。。。。。火山图 分析 显示 出 的 蛋白质 （（p <0,05 和> 2 倍 离子） 仅 存 在于 表达 表达 的 单一 蛋白质 蛋白质 （图 3D 红色 绿色点 。。。））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analýza sopečného grafu odhalila významne obohatené proteíny (p<0,05 a >2x iónová sila), ako aj jednotlivé proteíny prítomné iba v expresnej línii miniSOG (červené a zelené bodky na obr. 3d).Kombináciou týchto údajov sme identifikovali 1364, 461 a 911 štatisticky významných jadrových, mitochondriálnych a ER proteínov vonkajšej membrány.Na analýzu presnosti PDPL lokalizovaného v organelách sme použili MitoCarta 3.0, analýzu génovej ontológie (GO) a A. Ting et al.súbor údajov8 sa použil pre mitochondrie, jadro a ER na testovanie organelovej špecificity detegovaných proteínov, čo zodpovedá presnosti 73,4, 78,5 a 73,0 % (obr. 3e).Špecifickosť PDPL potvrdzuje, že PDPL je ideálnym nástrojom na identifikáciu proteómov špecifických pre organely.Predovšetkým, submitochondriálna analýza identifikovaných mitochondriálnych proteínov ukázala, že zachytený proteóm bol distribuovaný hlavne v matrici a vnútornej membráne (226 a 106, v tomto poradí), čo predstavuje 91,7 % (362) z celkového počtu identifikovaných mitochondriálnych proteínov.dodatočne sa potvrdila vysoká hladina PDPL (doplnkový obrázok 7a).Podobne subnukleárna analýza ukázala, že zachytený proteóm bol distribuovaný hlavne v jadre, nukleoplazme a jadierku (doplnkový obrázok 7b).Jadrová proteomická analýza so signálnym peptidom jadrovej lokalizácie (3xNLS) ukázala podobnú presnosť ako konštrukt H2B (doplnkový obrázok 7c – h).Na určenie špecificity markera PDPL sa zvolil jadrový laminín A ako diskrétnejšie lokalizovaný pasca POI7.PDPL identifikovalo 36 významne obohatených proteínov, z ktorých 12 proteínov (30,0 % vrátane laminu A) boli dobre charakterizované proteíny interagujúce s laminom A anotované databázou String, s vyšším percentom ako metóda BioID (122 proteínov) 28 z 28. , 22.9 %) 7. Naša metóda identifikovala menej proteínov, pravdepodobne kvôli obmedzeným oblastiam značenia, čo umožnilo aktívnejšie singletové kyslíky.GO analýza ukázala, že identifikované proteíny sa nachádzali hlavne v nukleoplazme (26), jadrovej membráne (10), jadrovej membráne (9) a jadrových póroch (5).Súhrnne tieto proteíny lokalizované v jadre predstavovali 80 % obohatených proteínov, čo ďalej dokazuje špecifickosť PDPL (doplnkový obrázok 8a – d).
Po zistení schopnosti PDPL vykonávať označovanie blízkosti v organelách sme potom testovali, či je možné PDPL použiť na analýzu väzbových partnerov POI.Najmä sme sa snažili definovať PDPL analýzu cytosolických proteínov, ktoré sa považujú za ťažšie ciele ako ich membránovo lokalizované náprotivky kvôli ich vysoko dynamickej povahe.Bromodoména a extraterminálny (BET) proteín BRD4 pritiahol našu pozornosť pre svoju kľúčovú úlohu pri rôznych ochoreniach 35, 36 .Komplex tvorený BRD4 je transkripčný koaktivátor a dôležitý terapeutický cieľ.Reguláciou expresie c-myc a Wnt5a transkripčných faktorov sa BRD4 považuje za kľúčový determinant akútnej myeloidnej leukémie (AML), mnohopočetného myelómu, Burkittovho lymfómu, rakoviny hrubého čreva a zápalových ochorení37,38.Okrem toho sa niektoré vírusy zameriavajú na BRD4 na reguláciu vírusovej a bunkovej transkripcie, ako je napríklad papilomavírus, HIV a SARS-CoV-236,39.
Na mapovanie interakcie BRD4 pomocou PDPL sme skombinovali miniSOG s krátkou izoformou N- alebo C-konca BRD4.Proteomické výsledky odhalili vysoký stupeň prekrývania medzi týmito dvoma konštruktmi (doplnkový obrázok 9a).Jadrový proteóm identifikovaný pomocou miniSOG-H2B pokrýva 77,6 % proteínov interagujúcich s BRD4 (doplnkový obrázok 9b).Potom sa na nastavenie polomeru markera použili rôzne časy osvetlenia (2, 5, 10, 20 minút) (obr. 4a a doplnkové údaje 3).Dospeli sme k záveru, že pri kratších fotoperiódach bude PDPL primárne označovať priamych väzbových partnerov, zatiaľ čo dlhšie obdobia budú zahŕňať proteíny identifikované počas kratších období fotoaktivácie, ako aj nepriame ciele v značiacich komplexoch.V skutočnosti sme zistili silné prekrytie medzi susednými časovými bodmi (84,6 % počas 2 a 5 minút; 87,7 % počas 5 a 10 minút; 98,7 % počas 10 a 20 minút) (obr. 4b a doplnkový obrázok 9c).Vo všetkých experimentálnych skupinách sme našli nielen samooznačenie BRD4, ale niekoľko známych cieľov, ako sú MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A a HMGB1 anotovaných v databáze reťazcov.Iónová sila týchto cieľov je úmerná času expozície (obr. 4c a doplnkový obrázok 9d).GO analýza proteínov identifikovaných v 2-minútovej skupine ukázala, že identifikované proteíny boli lokalizované v jadre a podieľali sa na remodelácii chromatínu a funkcii RNA polymerázy.Molekulárna funkcia proteínu bola obohatená o väzbu chromatínu alebo transkripčnú koaktiváciu, čo je v súlade s funkciou BRD4 (obr. 4d).Analýza interakcie proteínov s povolenou databázou reťazcov odhalila prvú úroveň nepriamych interakcií medzi komplexmi interagujúcimi s rodinou BRD4 a HDAC, ako sú SIN3A, NCOR2, BCOR a SAP130 (obr. 4e a doplnkový obrázok 9e), v súlade s acetylovanými histónmi viažucimi BRD4 a HDAC ..Navyše reprezentatívne ciele identifikované pomocou LC-MS/MS, vrátane Sin3A, NSUN2, Fus a SFPQ, boli potvrdené Western blotovaním (obr. 4f).Nedávno sa uvádza, že krátka izoforma BRD4 tvorí jadrá s vlastnosťami separácie kvapalina-kvapalina (LLPS).Proteíny viažuce RNA Fus a SFPQ sprostredkovávajú LLPS rôznych bunkových procesov a boli tu identifikované ako nezaznamenané proteíny viažuce BRD4.Interakcia medzi BRD4 a SFPQ bola potvrdená koimunoprecipitačnými (ko-IP) experimentmi (obrázok 4g), čo naznačuje ďalší mechanizmus separácie kvapalina-kvapalina sprostredkovaný BRD4, ktorý si zaslúži ďalšie skúmanie.Celkovo tieto výsledky naznačujú, že PDPL je ideálnou platformou na identifikáciu známych BRD4 interagujúcich, ako aj neznámych väzbových proteínov.
a Schematické znázornenie značenia blízkosti BRD4 sprostredkovaného miniSOG, expozičné časy: 2, 5, 10 a 20 min.b Prekrytie proteínov identifikovaných pri rôznych časoch osvetlenia.Proteínové obohatenie identifikované v HEK293T-miniSOG-BRD4 bolo štatisticky významné v porovnaní s divokým typom HEK293T.c Intenzita iónov pri kvantifikácii neznačených reprezentatívnych známych proteínov viažucich BRD4 počas špecifikovaného času expozície.n = 3 biologicky nezávislé vzorky.Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka.d Génová ontologická analýza (GO) proteínov identifikovaných v 2-minútovej skupine.Je uvedených prvých desať termínov GO.Bubliny sú zafarbené podľa kategórie výrazov GO a veľkosť bubliniek je úmerná počtu proteínov nachádzajúcich sa v každom výraze.e Reťazcová analýza proteínov interagujúcich s BRD4.Žlté kruhy sú priame lepidlo a sivé kruhy sú prvou vrstvou nepriameho lepidla.Červené čiary predstavujú experimentálne určené interakcie a modré čiary predstavujú predpovedané interakcie.f Reprezentatívne BRD4 väzbové ciele identifikované v LC-MS/MS boli overené Western blotovaním.g Koimunoprecipitačné experimenty potvrdzujú interakciu medzi SFPQ a BRD4.Tieto experimenty sa nezávisle opakovali aspoň dvakrát s podobnými výsledkami.Nespracované údaje sa poskytujú vo forme súborov s nespracovanými údajmi.
Okrem identifikácie neregistrovaných cieľov spojených s POI predpokladáme, že PDPL bude vhodný na identifikáciu substrátov pre enzýmy, čo by vyžadovalo charakterizáciu nepriamych väzbových proteínov vo veľkých komplexoch na anotáciu neregistrovaných substrátov.Parkin (kódovaný PARK2) je E3 ligáza a je známe, že mutácie parkínu spôsobujú autozomálne recesívnu juvenilnú Parkinsonovu chorobu (AR-JP)42.Okrem toho bol parkín opísaný ako nevyhnutný pre mitofágiu (mitochondriálnu autofágiu) a odstránenie reaktívnych foriem kyslíka.Hoci bolo identifikovaných niekoľko parkínových substrátov, úloha parkínu pri tomto ochorení zostáva nejasná.Na anotáciu svojich necharakterizovaných substrátov sa PDPL testoval pridaním miniSOG na N- alebo C-koniec parkínu.Bunky boli ošetrené karbonylkyanidovým protónovým transportérom m-chlórfenylhydrazónom (CCCP), aby sa aktivoval parkín prostredníctvom PINK1-Parkinovej dráhy.V porovnaní s našimi výsledkami BRD4 PDPL odhalila fúzia parkínu N-konca väčší súbor cieľových proteínov, hoci pokrývala väčšiu časť C-konca (177 z 210) (obrázok 5a, b a doplnkové údaje 4).výsledok je v súlade so správami, že N-terminálne značky môžu aberantne aktivovať Parkin44.Prekvapivo bolo v našich údajoch s publikovanými výsledkami AP-MS pre Parkin43 iba 18 prekrývajúcich sa proteínov, pravdepodobne kvôli rozdielom medzi bunkovými líniami a proteomickými pracovnými postupmi.Okrem štyroch známych proteínov (ARDM1, HSPA8, PSMD14 a PSMC3) identifikovaných dvoma metódami (obr. 5c)43.Na ďalšie overenie výsledkov LC-MS/MS sa na porovnanie výsledkov testu rodičovských buniek HEK293T a stabilnej N-terminálnej parkínovej línie použilo ošetrenie PDPL a následné Western blotting.Doteraz neznáme ciele CDK2, DUT, CTBP1 a PSMC4 boli testované so známym spojivom DNAJB1 (obr. 5d).
Vulkánový graf proteínov interagujúcich s parkínom v bunkách HEK293T so stabilne exprimovaným miniSOG fúzovaným na N- alebo C-koniec parkínu (n = 3 nezávislé biologické experimenty).Na pozemkoch sopiek sa použil dvojstranný Studentov t-test.HEK293T sa použil ako negatívna kontrola. Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v intenzite iónov). Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v intenzite iónov). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a >2-кратная разнтица вовининина). Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v intenzite iónov).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a > 2-кратная разнициой в ). Výrazne zmenené proteíny sú zvýraznené červenou farbou (p < 0,05 a > 2-násobný rozdiel v iónovej sile).Súvisiace proteíny dôležité pre HEK293T-miniSOG, ale nie dôležité pre HEK293T, sú zobrazené zelenou farbou.b Vennov diagram znázorňujúci prekrývajúce sa proteíny medzi N-terminálnymi a C-terminálnymi konštruktmi.N-terminálne značky môžu aberantne aktivovať parkín a viesť k lepšie rozpoznateľným proteínom.c Vennov diagram ukazujúci prekrývajúce sa proteíny medzi PDPL a AP-MS.Sú uvedené známe interaktory, vrátane 4 z 18 prekrývajúcich sa proteínov a 11 zo 159 proteínov špecificky identifikovaných v PDPL.d Reprezentatívne ciele identifikované pomocou LC-MS/MS boli overené Western blotovaním.e Ssu72 a SNW1 boli identifikované ako neregistrované parkínové substráty.Tieto proteínové plazmidy označené FLAG sa transfekovali do HEK293T a HEK293T-Parkin-miniSOG, po čom nasledovalo ošetrenie CCCP v rôznych časových bodoch.Degradácia bola výraznejšia v línii Parkinovej nadmernej expresie.f Použitím inhibítora proteazómu MG132 sa potvrdilo, že proces degradácie Ssu72 a SNW1 je sprostredkovaný ubikvitináciou proteazómu.Tieto experimenty sa nezávisle opakovali aspoň dvakrát s podobnými výsledkami.Nespracované údaje sa poskytujú vo forme súborov s nespracovanými údajmi.
Je pozoruhodné, že proteíny identifikované pomocou PDPL musia zahŕňať proteíny viažuce parkín a ich substráty.Na detekciu neregistrovaných parkínových substrátov sme vybrali sedem identifikovaných proteínov (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 a SNW1) a transfekované plazmidy, aby sme tieto gény vystavili normálnemu HEK293T a stabilne exprimovali miniSOG-Parkinovu liečbu HEKCCCP, po ktorej nasledovalo ošetrenie CC293T.Hladiny proteínov Ssu72 a SNW1 boli významne znížené v stabilnej línii miniSOG-Parkin (obr. 5e).Ošetrenie CCCP počas 12 hodín malo za následok najvýznamnejšiu degradáciu oboch substrátov.Aby sa zistilo, či je degradácia Ssu72 a SNW1 regulovaná ubikvitináciou proteazómu, pridal sa inhibítor proteazómu MG132 na inhibíciu aktivity proteazómu a v skutočnosti sme zistili, že ich degradačný proces bol inhibovaný (obr. 5f).Ďalšie nesubstrátové ciele boli potvrdené ako Parkinove interaktory pomocou Western blottingu (doplnkový obrázok 10), ktorý vykazoval konzistentné výsledky s LC-MS/MS.Na záver, integrácia pracovného toku PDPL s overením transfekcie cieľového proteínu umožňuje identifikáciu neregistrovaných substrátov E3 ligázy.
Vyvinuli sme spoločnú platformu na označovanie blízkosti, ktorá vám umožňuje identifikovať v priestore a čase interagujúce POI.Platforma je založená na miniSOG fotosenzibilizačnom proteíne, ktorý má len asi 12 kDa, čo je menej ako polovica veľkosti zrelého enzýmu APEX2 (27 kDa) a jedna tretina veľkosti TurboID (35 kDa).Menšia veľkosť by mala výrazne rozšíriť rozsah aplikácií na štúdium malých proteínových interaktómov.Na zvýšenie kvantového výťažku singletového kyslíka a rozšírenie citlivosti tohto prístupu je potrebné ďalšie skúmanie ďalších fotosenzibilizátorov, či už ide o geneticky kódované proteíny alebo malé molekuly.Pre aktuálnu verziu miniSOG je možné dosiahnuť vysoké časové rozlíšenie pomocou modrého osvetlenia na aktiváciu značiek priblíženia.Okrem toho dlhší expozičný čas uvoľnil väčší „oblak“ singletového kyslíka, čo viedlo k modifikácii distálnych histidínových zvyškov, zvýšenému polomeru značenia a schopnosti jemne doladiť priestorové rozlíšenie PDPL.Tiež sme testovali sedem chemických sond na zvýšenie pomeru signálu k pozadiu a skúmali sme molekulárny mechanizmus za týmto prístupom.Pracovný postup TOP-ABPP v kombinácii s nezaujatým otvoreným vyhľadávaním potvrdil, že modifikácie sa vyskytli iba v histidínoch a nebolo pozorované žiadne konzistentné mikroprostredie pre zvýšené histidínové modifikácie, s výnimkou miernej preferencie histidínov v oblasti slučky.
PDPL sa tiež použil na charakterizáciu subcelulárnych proteómov s proteómovou špecifickosťou a pokrytím prinajmenšom porovnateľným s iným blízkostným značením a metódami chemických sond špecifických pre organely.Markery blízkosti sa tiež úspešne použili na charakterizáciu povrchových, lyzozomálnych a sekretómových proteómov46, 47.Veríme, že PDPL bude kompatibilný s týmito subcelulárnymi organelami.Okrem toho sme spochybnili PDPL identifikáciou cieľov pre väzbu cytosolických proteínov, ktoré sú zložitejšie ako proteíny viazané na membránu v dôsledku ich dynamických vlastností a zapojenia sa do dočasnejších interakcií.PDPL sa aplikoval na dva proteíny, transkripčný koaktivátor BRD4 a ligázu E3 Parkin súvisiacu s ochorením.Tieto dva proteíny boli vybrané nielen pre ich základné biologické funkcie, ale aj pre ich klinický význam a terapeutický potenciál.Pre tieto dva body záujmu boli identifikovaní známi väzobní partneri, ako aj neregistrované ciele.Je pozoruhodné, že proteín SFPQ spojený s fázovou separáciou bol potvrdený ko-IP, čo môže naznačovať nový mechanizmus, ktorým BRD4 (krátka izoforma) reguluje LLPS.Zároveň sa domnievame, že identifikácia parkinových substrátov je scenár, v ktorom sa vyžaduje identifikácia nepriamych lepidiel.Identifikovali sme dva neidentifikované parkínové substráty a potvrdili sme ich degradáciu pozdĺž ubikvitinačnej-proteazómovej dráhy.Nedávno bola vyvinutá stratégia zachytávania založená na mechanizme na detekciu hydrolázových substrátov ich zachytením pomocou enzýmov.Hoci ide o veľmi výkonnú metódu, nie je vhodná na analýzu substrátov podieľajúcich sa na tvorbe veľkých komplexov a vyžaduje vytvorenie kovalentných väzieb medzi enzýmom a substrátom.Očakávame, že PDPL možno rozšíriť na štúdium ďalších proteínových komplexov a rodín enzýmov, ako sú rodiny deubikvitináz a metaloproteáz.
Nová forma miniSOG, nazývaná SOPP3, bola vyvinutá so zlepšenou produkciou singletového kyslíka.Porovnali sme miniSOG s SOPP3 a zistili sme zlepšený výkon označovania, hoci pomer signálu k šumu zostal nezmenený (doplnkový obrázok 11).Predpokladali sme, že optimalizácia SOPP3 (napr. prostredníctvom riadenej evolúcie) by viedla k efektívnejším fotosenzibilizačným proteínom, ktoré vyžadujú kratšie svetelné časy, a teda umožňujú zachytiť dynamickejšie bunkové procesy.Najmä súčasná verzia PDPL je obmedzená na bunkové prostredie, pretože vyžaduje osvetlenie modrým svetlom a nemôže preniknúť do hlbokých tkanív.Táto vlastnosť vylučuje jeho použitie v štúdiách zvieracích modelov.Kombinácia optogenetiky s PDPL by však mohla poskytnúť príležitosť na výskum na zvieratách, najmä v mozgu.Okrem toho iné skonštruované infračervené fotosenzibilizátory tiež odstraňujú toto obmedzenie.V súčasnosti prebieha výskum v tejto oblasti.
Bunková línia HEK293T bola získaná od ATCC (CRL-3216).Bunková línia bola testovaná negatívne na mykoplazmovú infekciu a bola kultivovaná v DMEM (Thermo, #C11995500BT) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS, Vistech, #SE100-B) a 1% penicilínom/streptomycínom (Hyclone, #SV30010).vyrastal v.
3-Aminofenylén (vzorka 3) a (4-etinylfenyl)metánamín (vzorka 4) boli zakúpené od Bidepharm.Propylamín (sonda 2) bol zakúpený od Energy-chemicals.N-(2-Aminofenyl)pent-4-ynamid (sonda 1) sa syntetizoval podľa publikovaných metód.
Doplnková tabuľka 1 uvádza genetické konštrukty použité v tejto štúdii.Sekvencie miniSOG a KillerRed boli klonované z darovaného plazmidu od P. Zou (Peking University).Mitochondriálna matricová targetingová sekvencia bola odvodená z 23 N-koncových aminokyselín COX4 a klonovaná do uvedených vektorov pomocou Gibsonovej zostavy (Beyotime, #D7010S).Na zacielenie na membránu a jadro endoplazmatického retikula sa použila SEC61B ľudská DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplifikovaná pomocou PCR z cDNA knižnice buniek HEK293T a H2B DNA (darované D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) a klonované, ako je uvedené vyššie.Pokiaľ nie je uvedené inak, ďalšie proteínové gény použité na transfekciu a konštrukciu stabilných bunkových línií boli amplifikované PCR z knižnice cDNA buniek HEK293T.G3S (GGGS) a G4S (GGGGS) sa použili ako linkery medzi návnadovým proteínom a miniSOG.K týmto fúznym konštruktom sa pridal V5 epitop tag (GKPIPNPLLGLDST).Na expresiu u cicavcov a na vytvorenie stabilnej bunkovej línie sa miniSOG fúzny konštrukt subklonoval do lentivírusového vektora pLX304.Na bakteriálnu expresiu sa miniSOG klonoval do vektora pET21a označeného 6xHis na C-konci.
Bunky HEK293T sa vysiali v množstve 2,0 x 105 buniek na jamku na šesťjamkové platne a o 24 hodín neskôr sa transfekovali rekombinantnými lentivírusovými plazmidmi (2,4 μg pLX304) a vírusovými baliacimi plazmidmi (1,5 μg psPAX2 a 1,2 μg (1,2 μg psPAX2 a 1,2 μg Lipo80 μg s p0MD) , #C0533), približne 80 % fúzie.Po transfekcii cez noc sa médium vymenilo a inkubovalo sa ďalších 24 hodín.Odber vírusu sa uskutočnil po 24, 48 a 72 hodinách.Pred infekciou cieľových bunkových línií sa vírusové médium prefiltrovalo cez 0,8 μm filter (Merck, #millex-GP) a pridal sa polybrén (Solarbio, #H8761) do koncentrácie 8 μg/ml.Po 24 hodinách sa bunky nechali zotaviť výmenou média.Bunky boli vybrané s použitím 5 ug/ml blasticidínu (Solarbio, #3513-03-9) pre prvé tri pasáže ako menej prísna selekcia.Potom sa použilo 20 μg/ml ako prísnejší režim pre ďalšie tri pasáže.
Bunky sa naočkovali do 12-jamkových komôr (Ibidi, #81201) v hustote približne 20 000 buniek na jamku.Na zlepšenie adhézie buniek HEK293T pridajte 50 ug/ml fibronektínu (Corning, #356008) zriedeného vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS, Sangon, #B640435) pri 37 °C.Komory boli vopred ošetrené počas 1 hodiny a potom odstránené pomocou PBS.Po 24 hodinách sa bunky raz premyli PBS, inkubovali sa s 1 mM sondou 3 v čerstvom Hanksovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS, Gibco, #14025092) počas 1 hodiny pri 37 °C a potom sa inkubovali s modrou LED (460 nm ).) boli ožarované počas 10 minút pri teplote miestnosti.Potom boli bunky dvakrát premyté PBS a fixované 4% formaldehydom v PBS (Sangon, #E672002) počas 15 minút pri teplote miestnosti.Nadbytok formaldehydu sa odstránil z fixovaných buniek trojnásobným premytím PBS.Bunky sa potom permeabilizovali s 0,5 % Triton X-100 (Sangon, #A600198) v PBS a premyli sa 3-krát s PBS.Potom vyberte komôrku a pridajte ku každej vzorke 25 µl klikacej reakčnej zmesi obsahujúcej 50 µM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) a 0,5 mg/ml askorbátu sodného (Aladdin, č. S105024) a inkubovali sa 30 minút pri teplote miestnosti.Po rýchlej reakcii boli bunky šesťkrát premyté PBS obsahujúcim 0,05 % Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) a potom blokované 5 % BSA (Abcone, #B24726) v PBST počas 30 minút pri teplote miestnosti.
Na kolokalizačné imunofarbenie sa bunky inkubovali s primárnymi protilátkami podľa uvedených podmienok: myšia anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), králičia anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABClonal, #A0564), králičia polyklonálna anti-kalnexínová protilátka (1:500, Abcam, #ab22595) alebo králičia anti-lamin A/C monoklonálna protilátka (1:500; CST, #2032) pri 4 °C cez noc.Po trojnásobnom premytí PBST boli bunky inkubované so sekundárnymi protilátkami: kozia anti-králičia Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) zriedená 1:1000, kozia anti-myšia Alexa Fluor 594 (CST, #8889) zriedená 1:1000.riedenie Riedi sa pri izbovej teplote 30 minút.Bunky sa potom trikrát premyli PBST a kontrastne sa farbili s DAPI (Thermo, #D1306) v PBS počas 10 minút pri teplote miestnosti.Po 3 premytiach PBS boli bunky uzavreté v 50% glycerole (Sangon, #A600232) v PBS na zobrazenie.Imunofluorescenčné snímky sa získali pomocou konfokálneho mikroskopu ZEISS LSM 900 Airyscan2 a softvéru ZNE 3.5.
Na fluorescenčné zobrazovanie singletovým kyslíkom sa bunky dvakrát premyli Hanksovým HEPES pufrom pred pridaním 100 nM Si-DMA v Hanksovom HEPES pufri (DOJINDO, #MT05).Po vystavení svetlu boli bunky inkubované v CO2 inkubátore pri 37 °C počas 45 minút.Bunky sa potom dvakrát premyli Hanksovým HEPES tlmivým roztokom a kontrastne sa farbili s Hoechst v Hanksovom HEPES tlmivom roztoku počas 10 minút pri teplote miestnosti a vizualizovali sa pomocou konfokálneho mikroskopu ZEISS LSM 900., #M36008) v HBSS pufri obsahujúcom vápnik a horčík.Po vystavení svetlu alebo doxorubicínu (MCE, #HY-15142A) sa bunky inkubovali v C02 inkubátore pri 37 °C počas 10 minút, premyli sa dvakrát HBSS pufrom a inkubovali sa s Hoechstom v HBSS pufri pri teplote miestnosti.minút.Doxorubicín sa použil ako pozitívna kontrola sondy, kde boli bunky ošetrené 20 uM doxorubicínu v HBSS obsahujúcom 1% BSA počas 30 minút.Imunofluorescenčné obrázky sa získali pomocou konfokálneho mikroskopu Zeiss LSM 900.
Bunky HEK293T stabilne exprimujúce mito-miniSOG sa naočkovali v hustote približne 30 % do 15 cm misiek.Po 48 hodinách, keď sa dosiahlo ~80% konfluencie, sa bunky raz premyli PBS, inkubovali sa s 1 mM sondou 3 v čerstvom pufri HBSS počas 1 hodiny pri 37 °C a potom sa osvetlili modrou LED na 10 minút pri teplote miestnosti. teplota..Potom boli bunky dvakrát premyté PBS, zoškrabané a resuspendované v ľadovo studenom PBS pufri obsahujúcom inhibítory proteázy bez EDTA (MCE, #HY-K0011).Bunky boli lyzované sonikáciou špičky počas 1 minúty (1 sekunda zapnutá a 1 sekunda vypnutá pri 35 % amplitúde).Výsledná zmes sa centrifugovala pri 15 871 xg počas 10 minút pri 4 °C, aby sa odstránili zvyšky, a koncentrácia supernatantu sa upravila na 4 mg/ml pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (Beyotime, #P0009).Skombinujte 1 ml vyššie uvedeného lyzátu s 0,1 mM fotodegradovateľným biotín azidom (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM ligandom TBTA (Aladdin, #T162437) a 1 mM inkubátora s CuSO4 otáčaním po dobu 1 hodiny pri izbovej teplote.Po rýchlej reakcii pridajte zmes do vopred namiešaného roztoku (MeOH:CHCl3:H20 = 4 ml:1 ml:3 ml) v 10 ml sklenenej fľaštičke.Vzorky sa zmiešali a centrifugovali pri 4500 g počas 10 minút pri teplote miestnosti.Spodný a horný roztok sa vyhodili, zrazenina sa dvakrát premyla 1 ml metanolu a centrifugovala sa pri 15871 x g počas 5 minút pri 4 °C.Pridajte 1 ml 8 M močoviny (Aladdin, č. U111902) v 25 mM hydrogénuhličitanu amónnom (ABC, Aladdin, č. A110539), aby sa zrazenina rozpustila.Vzorky sa rekonštituovali s 10 mM ditiotreitolom (Sangon, č. A100281 v 25 mM ABC) počas 40 minút pri 55 °C, po čom nasledovalo pridanie 15 mM čerstvého jódacetamidu (Sangon, č. A600539) pri teplote miestnosti v tme.Alkylácia do 30 minút..Na zastavenie reakcie sa pridalo ďalších 5 mM ditiotreitolu.Pripravte približne 100 µl agarózových guľôčok NeutrAvidin (Thermo, #29202) pre každú vzorku premytím 3-krát 1 ml PBS.Vyššie uvedený roztok proteómu sa zriedil s 5 ml PBS a inkuboval sa s vopred premytými agarózovými guľôčkami NeutrAvidin počas 4 hodín pri teplote miestnosti.Guľôčky sa potom premyli 3-krát 5 ml PBS s obsahom 0,2 % SDS (Sangon, #A600485), 3-krát 5 ml PBS s obsahom 1M močoviny a 3-krát 5 ml ddH20.Guľôčky sa potom zozbierali centrifugáciou a resuspendovali v 200 ul 25 mM ABC s obsahom 1 M močoviny, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) a 20 ng/ul trypsínu (Promega, #V5280).Trypsinizácia cez noc pri 37 °C s rotáciou.Reakcia sa zastavila pridaním kyseliny mravčej (Thermo, # A117-50), kým pH nedosiahlo 2-3.Guľôčky sa premyli 3-krát 1 ml PBS s obsahom 0,2 % SDS, 3-krát 1 ml PBS s obsahom 1 M močoviny a potom 3-krát 1 ml destilovanej vody.Modifikované peptidy sa uvoľnili svetelnou lýzou (365 nm) počas 90 minút s použitím 200 ul 70 % MeOH.Po odstredení sa supernatant zhromaždil.Guľôčky sa potom raz premyli 100 ul 70 % MeOH a supernatanty sa spojili.Vzorky sa vysušili vo vákuovom koncentrátore Speedvac a uskladnili pri -20 °C až do analýzy.
Na identifikáciu a kvantifikáciu peptidov modifikovaných singletovým kyslíkom sa vzorky znovu rozpustili v 0,1 % kyseline mravčej a 1 μg peptidov sa analyzoval pomocou hmotnostného spektrometra Orbitrap Fusion Lumos Tribrid vybaveného nano ESI zdrojom od Tune a Xcalibur od dodávateľského softvéru 4.3.Vzorky boli oddelené na 75 um x 15 cm vnútorne naplnenej kapilárnej kolóne s 3 um C18 materiálom (ReproSil-pur, #r13.b9.) a pripojené k systému EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptidy sa separovali lineárnou 95-minútovou gradientovou chromatografiou z 8 % rozpúšťadla B do 50 % rozpúšťadla B (A = 0,1 % kyseliny mravčej vo vode, B = 0,1 % kyseliny mravčej v 80 % acetonitrile), potom sa lineárne zvýšilo na 98 % B min. za 6 minút pri prietoku 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos zhromažďuje údaje striedavo medzi úplným skenovaním MS a skenovaním MS2 v závislosti od údajov.Rozprašovacie napätie bolo nastavené na 2,1 kV a teplota iónovej transportnej kapiláry bola 320 °C.MS spektrá (350-2000 m/z) sa zbierali s rozlíšením 120 000, AGC 4 x 105 a maximálnym vstupným časom 150 ms.10 najbežnejších viacnásobne nabitých prekurzorov v každom úplnom skenovaní bolo fragmentovaných pomocou HCD s normalizovanou energiou kolízie 30 %, kvadrupólovým izolačným oknom 1,6 m/z a nastavením rozlíšenia 30 000.Cieľ AGC pre tandemovú hmotnostnú spektrometriu s použitím 5×104 a maximálnym vstupným časom 150 ms.Dynamická výnimka je nastavená na 30 sekúnd. Nepriradené ióny alebo ióny s nábojom 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté. Nepriradené ióny alebo ióny s nábojom 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nepriradené ióny alebo ióny s nábojom 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nešpecifikované ióny alebo ióny s nábojmi 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté.
Surové dáta sú spracované pomocou výpočtovej platformy FragPipe založenej na MSFragger.Hmotnostné odchýlky a zodpovedajúce aminokyseliny boli stanovené pomocou otvoreného vyhľadávacieho algoritmu s toleranciou hmotnosti prekurzora -150 až 500 Da.Modifikované peptidy sa potom identifikovali pomocou modifikácií histidínu s hmotnostnými prírastkami +229,0964 a +247,1069 Da v PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Bunky stabilne exprimujúce fúzovaný gén miniSOG sa umiestnili na 6 cm misky.Po dosiahnutí ~80% konfluencie sa bunky raz premyli HBSS (Gibco, #14025092), potom sa inkubovali s chemickými sondami v HBSS počas 1 hodiny pri 37 °C a osvetlili sa modrým svetlom.10W LED po dobu 20 minút pri izbovej teplote.Na určenie, ktorý typ reaktívnych foriem kyslíka sa podieľa na PDPL, 0,5 mM vitamín C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Ako doplnky sa k bunkám pridal 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 uM H202, 10 mM NaN3.Po premytí studeným PBS boli bunky zoškrabané, zozbierané do 1,5 ml centrifugačných skúmaviek a sonikované špičkou počas 1 minúty v 200 ul PBS s 1x inhibítorom proteázy bez EDTA (1 s a 1 s bez, amplitúda 35 %).Výsledná zmes sa centrifugovala pri 15 871 x g počas 10 minút pri 4 °C a koncentrácia supernatantu sa upravila na 1 mg/ml pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA.Približne 50 ul vyššie uvedeného lyzátu sa inkubovalo s 0,1 mM rodamín azidom (Aladdin, č. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandom a 1 mM CuS04 počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s rotáciou zdola nahor.Po click reakcii sa uskutočnilo zrážanie acetónom pridaním 250 ul vopred vychladeného acetónu do vzoriek, inkubáciou pri -20 °C počas 20 minút a centrifugáciou pri 6010 x g počas 10 minút pri 4 °C.Peleta sa odoberie a varí sa v 50 µl 1x Laemmliho tlmivého roztoku počas 10 minút pri 95 °C.Vzorky sa potom analyzovali na dlhých géloch SDS-PAGE a vizualizovali sa pomocou zobrazovacieho systému Bio-rad ChemiDoc MP Touch so softvérom Image Lab Touch.
Expresia a purifikácia rekombinantného miniSOG-6xHis proteínu sa uskutočnila tak, ako bolo opísané vyššie.V stručnosti, bunky E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) sa transformovali s pET21a-miniSOG-6xHis a expresia proteínu sa indukovala s 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Po bunkovej lýze boli proteíny purifikované pomocou Ni-NTA agarózových guľôčok (MCE, č. 70666), dialyzované proti PBS a skladované pri -80 °C.
Pre in vitro test blízkosti označenia na báze protilátky zmiešajte 100 μM purifikovaného miniSOG, 1 mM sondy 3 a 1 μg antiznačkovej myšacej monoklonálnej protilátky (TransGen, #HT501-01) v PBS na celkový reakčný objem 50 μl..Reakčná zmes sa ožarovala modrým LED svetlom počas 0, 2, 5, 10 a 20 minút pri teplote miestnosti.Zmes sa inkubovala s 0,1 mM biotín-PEG3-azidom (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandom a 1 mM CuS04 počas 1 hodiny pri teplote miestnosti na trepačke s pohybom nahor.Po bleskovej reakcii pridajte 4x Laemmliho tlmivý roztok priamo do zmesi a varte pri 95°C 10 min.Vzorky sa analyzovali na SDS-PAGE géloch a analyzovali sa westernovým prenosom so streptavidínom-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Syntetický peptid obsahujúci histidín s C-koncovou amidáciou (LHDALDAK-CONH2) sa použil na analýzu in vitro značenia na báze peptidov.V tomto teste sa 100 uM purifikovaného miniSOG, 10 mM sondy 3 a 2 ug/ml syntetického peptidu zmiešalo v PBS v celkovom reakčnom objeme 50 ul.Reakčná zmes sa ožarovala modrým LED svetlom počas 1 hodiny pri teplote miestnosti.Jeden mikroliter vzorky sa analyzoval pomocou systému LC-MS (Waters, hmotnostný spektrometer SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight so softvérom na analýzu spektra MassLynx).
Bunky HEK293T stabilne exprimujúce fúzny gén miniSOG sa naočkovali do 10 cm misiek pre línie s rôznou lokalizáciou organel (Mito, ER, Nucleus) a 15 cm misiek pre línie Parkin-miniSOG a BRD4-miniSOG.Po dosiahnutí ~90% konfluencie sa bunky raz premyli HBSS, potom sa inkubovali so sondou 3 v HBSS počas 1 hodiny pri 37 °C a osvetlili sa 10 W modrou LED pri teplote miestnosti.Na bezkontaktné značenie Parkina sa pridal 10 uM protónový karbonylkyanidový nosič m-chlórfenylhydrazón CCCP (Solarbio, #C6700) so sondou 3 v HBSS na 1 hodinu pri 37 °C.Kroky bunkovej lýzy, cvakacej chémie, redukcie a alkylácie boli rovnaké, ako je opísané vyššie, okrem toho, že sa pridali 2 mg lyzátu a namiesto fotodegradovateľného biotín azidu sa v click reakcii použil biotín PEG3 azid.Po obohatení sa guľôčky premyli 3-krát 5 ml PBS s obsahom 0,2 % SDS, 3-krát 5 ml PBS s obsahom 1 M močoviny a 3-krát 5 ml PBS.Potom sa 2 ug trypsínu pridali do 300 ul 25 mM ABC obsahujúceho 1 M močovinu na štiepenie proteínu cez noc pri 37 °C.Reakcia sa zastavila pridávaním kyseliny mravčej, kým sa nedosiahlo pH 2-3.Po trypsinizácii na guľôčkach sa peptidový roztok odsolil pomocou kolóny SOLAu HRP (Thermo, #60209-001) a vysušil sa vo vákuovom koncentrátore Speedvac.Peptidy sa znova rozpustili v 0,1 % kyseline mravčej a analyzovalo sa 500 ng peptidov pomocou hmotnostného spektrometra Orbitrap Fusion Lumos Tribrid vybaveného zdrojom nano-ESI opísaným vyššie.Peptidy boli separované na komerčných RP-HPLC predkolónach (75 um x 2 cm) (Thermo, č. 164946) a analytických RP-HPLC kolónach (75 um x 25 cm) (Thermo, č. 164941), obe naplnené 2 um.gradient od 8 % do 35 % ACN za 60 minút, potom sa lineárne zvýšil na 98 % B za 6 minút pri prietoku 300 Nl/min.MS spektrá (350-1500 m/z) sa zbierali s rozlíšením 60 000, AGC 4 × 105 a maximálnym vstupným časom 50 ms.Vybrané ióny boli postupne fragmentované pomocou HCD v 3 s cykloch s normalizovanou energiou kolízie 30 %, kvadrupólovým izolačným oknom 1,6 m/z a rozlíšením 15 000. 5 × 104 tandemový hmotnostný spektrometer AGC cieľ a maximálny čas vstreku 22 ms.Dynamické vylúčenie je nastavené na 45 sekúnd. Nepriradené ióny alebo ióny s nábojom 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté. Nepriradené ióny alebo ióny s nábojom 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nepriradené ióny alebo ióny s nábojom 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nešpecifikované ióny alebo ióny s nábojmi 1+ a >7+ boli pre MS/MS odmietnuté.
Kroky prípravy vzorky až po obohatenie guľôčok NeutrAvidínu boli rovnaké ako pri analýze LC-MS/MS opísanej vyššie.Približne 50 ug lyzátu sa použilo ako vstup na kontrolu nanášania a 2 mg lyzátu sa použili na klikacie reakcie.Po obohatení a premytí neutravidínom sa naviazané proteíny eluovali pridaním 50 μl Laemmliho tlmivého roztoku k guľôčkam agarózovej živice a varom pri 95 °C počas 5 minút.Kontrolný vstup a vzorky obohatené o guľôčky sa analyzovali pomocou SDS-PAGE a preniesli sa na PVDF membrány (Millipore, #ISEQ00010) štandardnými metódami Western blot.Membrány boli blokované 5% odstredeným mliekom (Sangon, #A600669) v TBS obsahujúcom 0,1% tween-20 (TBST) a inkubované postupne s primárnymi a sekundárnymi protilátkami.Primárne protilátky boli zriedené 1:1000 v 5% odstredenom mlieku v TBST a inkubované cez noc pri 4 °C.Sekundárne protilátky sa použili v pomere 1:5000 a inkubovali sa 1 hodinu pri teplote miestnosti.Membrány sa vizualizovali chemiluminiscenciou s použitím zobrazovacieho systému Chemidoc MP.Všetky nerozrezané skeny blotov a gélov na obrázku sú prezentované ako nespracované údaje.
Primárne protilátky použité v tejto štúdii zahŕňali králičia anti-SFPQ monoklonálna protilátka (CST, č. 71992), králičia anti-FUS monoklonálna protilátka (CST, č. 67840), králičia anti-NSUN2 polyklonálna protilátka (Proteintech, č. 20854-1- AP), králičia anti-mSin3A polyklonálna protilátka (Abcam, #ab3479), myšacia monoklonálna protilátka proti značke (TransGen, #HT201-02), myšacia anti-p-aktínová monoklonálna protilátka (TransGen, #HC201-01), králičia anti -CDK2 monoklonálna protilátka (ABclonal, #A0094), králičia monoklonálna protilátka proti CTBP1 (ABclonal, #A11600), králičia polyklonálna protilátka proti DUT (ABclonal, #A2901), králičia polyklonálna protilátka proti PSMC4 (ABclonal, #A2505), králičia anti- DNAJB1 polyklonálna protilátka (ABclonal, # A5504).Tieto protilátky sa použili v riedení 1:1000 v 5% odstredenom mlieku v TBST.Sekundárne protilátky použité v tejto štúdii zahŕňali anti-králičie IgG (TransGen, #HS101-01), anti-myšie IgG (TransGen, #HS201-01) v riedení 1:5000.
Aby sa ďalej preskúmalo, či BRD4 interaguje s SFPQ, stabilné bunky HEK293T a BRD4-miniSOG nadmerne exprimujúce HEK293T sa naniesli na 10 cm misky.Bunky boli premyté studeným PBS a lyzované v 1 ml Pierce IP lyzačného pufra (Thermo Fisher, #87787) s inhibítorom proteázy bez EDTA počas 30 minút pri 4 °C.Potom boli lyzáty zozbierané do 1,5 ml centrifugačných skúmaviek a centrifugované pri 15 871 xg počas 10 minút pri 4 °C.Supernatant bol zozbieraný a inkubovaný s 5 ug anti-V5 značenej myšacej monoklonálnej protilátky (CST, #80076) cez noc pri 4 °C.Premyte približne 50 ul magnetických guľôčok proteínu A/G (MCE, #HY-K0202) dvakrát pomocou PBS s obsahom 0,5 % Tween-20.Potom boli bunkové lyzáty inkubované s magnetickými guľôčkami počas 4 hodín pri 4 °C s rotáciou zdola nahor.Potom sa guľôčky štyrikrát premyli 1 ml PBST pufra a varili sa pri 95 °C počas 5 minút.Vzorky boli analyzované na SDS-PAGE géloch a prenesené na PVDF membrány použitím štandardných metód Western blot.Membrány boli blokované v 5% odstredenom mlieku v TBST a inkubované postupne s primárnymi a sekundárnymi protilátkami.Primárna protilátka Králičia anti-SFPQ monoklonálna protilátka (CST, #71992) sa použila v pomere 1:1000 v 5 % odstredenom mlieku v TBST a inkubovala sa cez noc pri 4 °C.Anti-králičí IgG sa použil v pomere 1:5000 a inkuboval sa 1 hodinu pri teplote miestnosti.Membrány sa vizualizovali chemiluminiscenciou s použitím zobrazovacieho systému Chemidoc MP.
Všetky štruktúry použité na analýzu plochy prístupnej k rozpúšťadlu (SASA) boli získané z Protein Data Bank (PDB)52 alebo AlphaFold Protein Structure Database53.Absolútna SASA bola vypočítaná pre každý zvyšok pomocou programu FreeSASA.Na získanie strednej hodnoty SASA pre každú štruktúru sa použili iba úplné a jednoznačné údaje SASA pre značený histidín a jeho susedov.Relatívna dostupnosť rozpúšťadla (RSA) pre každý histidín sa vypočítala vydelením absolútnej hodnoty SASA empirickým maximálnym možným povrchom zvyšku dostupným pre rozpúšťadlo.Všetky histidíny boli potom klasifikované ako skryté, ak bol priemerný RSA nižší ako 20 %, inak boli exponované56.
Nespracované súbory získané v režime DDA boli prehľadávané pomocou programu Proteome Discoverer (v2.5) alebo MSfragger (Fragpipe v15.0) v príslušnej overenej proteínovej databáze SwissProt obsahujúcej bežné kontaminanty.Peptidy vyžadovali kompletný trypsín s dvoma chýbajúcimi miestami štiepenia, karbamoylovú metyláciu ako fixnú modifikáciu a oxidáciu metionínu ako dynamickú modifikáciu.Tolerancie hmotnosti prekurzora a fragmentu boli nastavené na 10 ppm a 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Zásahy kontaminantov boli odstránené a proteíny boli filtrované, aby sa získala falošná miera objavenia <1%. Zásahy kontaminantov boli odstránené a proteíny boli filtrované, aby sa získala falošná miera objavenia <1%. Попадания загрязняющих веществ ыыли уалены, а аелки отéraьттрованы, получить кить кить кить кить кить кить кить кить кить. Zásahy kontaminantov sa odstránili a proteíny sa prefiltrovali, aby sa dosiahla falošná miera detekcie < 1 %.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 < 1 % 的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованя длованх жонтрованя длованх жонствойжне%. Zásahy kontaminantov sa odstránili a proteíny sa prefiltrovali, aby sa dosiahla miera falošne pozitívnych výsledkov < 1 %.Na kvantitatívnu analýzu bez použitia značiek sa použil normalizovaný obsah proteínu z troch biologických opakovaní.Analýza subcelulárnej lokalizácie proteínov sa uskutočnila pomocou analýzy génovej ontológie (GO) z DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 a databáz zostavených a publikovaných skupinou Alice Ting.Mapa sopky bola získaná z Perseus (v1.6.15.0). Násobné zmeny v hojnosti proteínov boli testované na štatistickú významnosť pomocou obojstranného t-testu a proteínové zásahy boli identifikované so zmenou hojnosti >2 (pokiaľ nie je uvedené inak) a hodnotou p <0,05. Násobné zmeny v hojnosti proteínov boli testované na štatistickú významnosť pomocou obojstranného t-testu a proteínové zásahy boli identifikované so zmenou hojnosti >2 (pokiaľ nie je uvedené inak) a hodnotou p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Násobkové zmeny obsahu proteínov sa testovali na štatistickú významnosť pomocou dvojstranného t-testu a zhody proteínov sa identifikovali so zmenou obsahu >2 (pokiaľ nie je uvedené inak) a hodnotou p <0,05.使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 丰度 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 丰度 变化> 2 （除非 有 说明） 和 和 P 值 <0,05。使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 变化> 2 （另 说明） 和 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Štatistická významnosť násobných zmien v obsahu proteínu sa testovala pomocou dvojstranného t-testu a zhody proteínov sa určili pre zmeny obsahu > 2 (pokiaľ nie je uvedené inak) a hodnoty p < 0,05.Analýza interakcie proteínov sa uskutočnila pomocou analýzy GO spolu s databázou reťazcov.
Boli uskutočnené tri biologické replikácie s podobnými výsledkami.Štatistická analýza bola vykonaná pomocou GraphPad Prism (softvér GraphPad) a grafy sopiek boli vytvorené pomocou Perseus (v1.6.15.0).Na porovnanie týchto dvoch skupín sa p-hodnoty určili pomocou dvojstranného Studentovho t-testu.Do grafov sopiek boli zahrnuté iba singletonové proteíny identifikované aspoň dvakrát v experimentálnej skupine a zodpovedajúce chýbajúce hodnoty v kontrolnej skupine boli nahradené Perseus z normálnej distribúcie, aby bolo možné vypočítať p-hodnotu.Chybové stĺpce predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku.V proteomických analýzach na štatistickú analýzu sa zachovalo množstvo proteínov, ktoré sa objavili v najmenej dvoch biologických replikátoch.Na predbežné určenie veľkosti vzorky neboli použité štatistické metódy.Experimenty nie sú náhodné.Vedci neboli počas experimentu a vyhodnocovania výsledkov k úlohám slepí.
Ďalšie informácie o dizajne štúdie nájdete v abstrakte Správy o výskume prírody, ktorý je prepojený s týmto článkom.
Údaje hmotnostnej spektrometrie získané v tejto štúdii boli odoslané konzorciu ProteomeXchange Consortium prostredníctvom partnerského úložiska iProX57 pod súborom údajov ID PXD034811 (súbor údajov PDPL-MS).Nespracované údaje sa poskytujú vo forme súborov s nespracovanými údajmi.Tento článok poskytuje pôvodné údaje.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Spoznávanie okolia: použitie biotinylácie závislej od blízkosti na charakterizáciu proteínových komplexov a mapovanie organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Spoznávanie okolia: použitie biotinylácie závislej od blízkosti na charakterizáciu proteínových komplexov a mapovanie organel.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Oboznámenie sa s okolím: používanie biotinylácie závislej od blízkosti na charakterizáciu proteínových komplexov a mapovanie organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pochopenie susedstva: využite závislosť okolia od biologického života.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Pochopenie blízkosti: charakterizácia proteínových komplexov a mapovanie organel pomocou biotinylácie závislej od blízkosti.Aktuálne.Môj názor.Chemický.biológia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB a kol.Mapovanie mikroprostredia prenosom Dexterovej energie do imunitných buniek.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL a kol.Siete s dvoma proteómami detegujú bunkovo ​​špecifickú remodeláciu ľudského interaktómu.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).