Správy

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Účinné fotosenzibilizátory sú obzvlášť dôležité pre široké klinické využitie fototerapie.Bežné fotosenzibilizátory však vo všeobecnosti trpia absorpciou krátkych vlnových dĺžok, nedostatočnou fotostabilitou, nízkym kvantovým výťažkom reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a zhášaním ROS vyvolaným agregáciou.Tu uvádzame blízky infračervený (NIR) supramolekulárny fotosenzibilizátor (RuDA) sprostredkovaný samoskladaním organokovových komplexov Ru (II)-arénu vo vodnom roztoku.RuDA môže generovať singletový kyslík (1O2) iba v agregovanom stave a vykazuje zjavné správanie pri generovaní 1O2 vyvolané agregáciou v dôsledku významného zvýšenia procesu kríženia medzi singlet-tripletovým systémom.Pri pôsobení laserového svetla 808 nm RuDA vykazuje kvantový výťažok 102 16,4 % (indocyanínová zeleň schválená FDA: ΦΔ=0,2 %) a vysokú účinnosť fototermálnej konverzie 24,2 % (komerčné zlaté nanorúdy) s vynikajúcou fotostabilitou.: 21,0 %, zlaté nanoškrupiny: 13,0 %).Okrem toho sa RuDA-NP s dobrou biokompatibilitou môžu prednostne akumulovať v miestach nádoru, čo spôsobuje významnú regresiu nádoru počas fotodynamickej terapie s 95, 2% znížením objemu nádoru in vivo.Táto fotodynamická terapia zvyšujúca agregáciu poskytuje stratégiu na vývoj fotosenzibilizátorov s priaznivými fotofyzikálnymi a fotochemickými vlastnosťami.
V porovnaní s konvenčnou terapiou je fotodynamická terapia (PDT) atraktívnou liečbou rakoviny vďaka jej významným výhodám, akými sú presná časopriestorová kontrola, neinvazívnosť, zanedbateľná lieková rezistencia a minimalizácia nežiaducich účinkov 1,2,3.Pri svetelnom ožiarení môžu byť použité fotosenzibilizátory aktivované za vzniku vysoko reaktívnych foriem kyslíka (ROS), čo vedie k apoptóze/nekróze alebo imunitným reakciám4,5. Avšak väčšina konvenčných fotosenzibilizátorov, ako sú chlóríny, porfyríny a antrachinóny, má relatívne krátku vlnovú dĺžku (frekvencia < 680 nm), čo má za následok slabý prienik svetla v dôsledku intenzívnej absorpcie biologických molekúl (napr. hemoglobínu a melanínu) v viditeľná oblasť6,7. Avšak väčšina konvenčných fotosenzibilizátorov, ako sú chlóríny, porfyríny a antrachinóny, má relatívne krátku vlnovú dĺžku (frekvencia < 680 nm), čo má za následok slabý prienik svetla v dôsledku intenzívnej absorpcie biologických molekúl (napr. hemoglobínu a melanínu) v viditeľná oblasť6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Avšak najbežnejšie fotosenzibilizátory, ako sú chlóríny, porfyríny a antrachinóny, majú relatívne krátku absorpciu vlnovej dĺžky (< 680 nm), čo má za následok slabý prienik svetla v dôsledku intenzívnej absorpcie biologických molekúl (napr. hemoglobínu a melanínu) do viditeľnej oblasti6,7.然而 ， 大多数 传统 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 卟啉 和 蒽醌 ， 具有 相对 较 波长 吸收 （频率 <680 nm） ， 因此 因此 由于 对 分子 血红 和 黑色素 的 的 强烈 吸收 ， ， ， ， ，导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 蒽醌 ， ， 相对 较 短 的 （频率 频率 <680 nm） 因此 因此 由于 分子 分子 （） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Avšak väčšina tradičných fotosenzibilizátorov, ako sú chlóríny, porfyríny a antrachinóny, má relatívne krátku absorpciu vlnovej dĺžky (frekvencia < 680 nm) v dôsledku silnej absorpcie biomolekúl, ako je hemoglobín a melanín, čo má za následok slabý prienik svetla.Viditeľná oblasť 6.7.Preto sú fotosenzibilizátory absorbujúce blízke infračervené žiarenie (NIR), ktoré sa aktivujú v „terapeutickom okne“ 700–900 nm, veľmi vhodné na fototerapiu.Keďže blízke infračervené svetlo je najmenej absorbované biologickými tkanivami, môže viesť k hlbšej penetrácii a menšiemu poškodeniu svetlom8,9.
Bohužiaľ, existujúce fotosenzibilizátory absorbujúce NIR majú vo všeobecnosti slabú fotostabilitu, nízku kapacitu tvorby singletového kyslíka (1O2) a zhášanie 1O2 vyvolané agregáciou, čo obmedzuje ich klinickú aplikáciu10,11.Hoci sa vynaložilo veľké úsilie na zlepšenie fotofyzikálnych a fotochemických vlastností konvenčných fotosenzibilizátorov, niekoľko správ doteraz uvádza, že fotosenzibilizátory absorbujúce NIR môžu vyriešiť všetky tieto problémy.Okrem toho sa ukázalo, že niekoľko fotosenzibilizátorov je prísľubom pre efektívnu tvorbu 10212,13,14 pri ožiarení svetlom nad 800 nm, pretože energia fotónu rýchlo klesá v blízkej IR oblasti.Trifenylamín (TFA) ako donor elektrónov a [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipyrido[a,c]fenazín (TDP) ako skupina akceptora elektrónov Donor-akceptor (DA) typ farbív triedy farbív absorbujúcich blízke infračervené žiarenie, ktoré boli rozsiahle študované pre biozobrazovanie v blízkej infračervenej oblasti II a fototermálnu terapiu (PTT) kvôli ich úzkej šírke pásma.Farbivá typu DA sa teda môžu použiť na PDT s excitáciou blízkou IR, hoci sa zriedka študovali ako fotosenzibilizátory pre PDT.
Je dobre známe, že vysoká účinnosť medzisystémového kríženia (ISC) fotosenzibilizátorov podporuje tvorbu 1O2.Spoločnou stratégiou na napredovanie v procese ISC je zvýšiť spin-orbitálne spojenie (SOC) fotosenzibilizátorov zavedením ťažkých atómov alebo špeciálnych organických skupín.Tento prístup má však stále určité nevýhody a obmedzenia19,20.Nedávno supramolekulárne samozostavenie poskytlo inteligentný prístup zdola nahor na výrobu funkčných materiálov na molekulárnej úrovni21, 22 s mnohými výhodami vo fototerapii: (1) samozostavené fotosenzibilizátory môžu mať potenciál vytvárať pásové štruktúry.Podobne ako elektronické štruktúry s hustejším rozložením energetických hladín v dôsledku prekrývajúcich sa dráh medzi stavebnými blokmi.Preto sa zlepší energetická zhoda medzi dolným singletovým excitovaným stavom (SI) a susedným tripletovým excitovaným stavom (Tn), čo je výhodné pre ISC proces 23, 24.(2) Supramolekulárne zostavenie zníži neradiačnú relaxáciu na základe mechanizmu obmedzenia intramolekulárneho pohybu (RIM), ktorý tiež podporuje proces ISC25,26.(3) Supramolekulárna zostava môže chrániť vnútorné molekuly monoméru pred oxidáciou a degradáciou, čím výrazne zlepšuje fotostabilitu fotosenzibilizátora.Vzhľadom na vyššie uvedené výhody sa domnievame, že systémy supramolekulárnych fotosenzibilizátorov môžu byť sľubnou alternatívou na prekonanie nedostatkov PDT.
Komplexy na báze Ru(II) sú sľubnou medicínskou platformou pre potenciálne aplikácie v diagnostike a terapii chorôb vďaka svojim jedinečným a atraktívnym biologickým vlastnostiam28,29,30,31,32,33,34.Okrem toho množstvo excitovaných stavov a laditeľné fotofyzikálno-chemické vlastnosti komplexov na báze Ru (II) poskytujú veľké výhody pre vývoj fotosenzibilizátorov na báze Ru (II)35, 36, 37, 38, 39, 40.Pozoruhodným príkladom je ruténium(II) polypyridylový komplex TLD-1433, ktorý je v súčasnosti vo fáze II klinických skúšok ako fotosenzibilizátor na liečbu nesvalovej invazívnej rakoviny močového mechúra (NMIBC)41.Okrem toho sa ruténium(II)arénové organokovové komplexy široko používajú ako chemoterapeutické činidlá na liečbu rakoviny kvôli ich nízkej toxicite a ľahkej modifikácii42,43,44,45.Iónové vlastnosti ru(II)-arénových organokovových komplexov môžu nielen zlepšiť zlú rozpustnosť DA chromofórov v bežných rozpúšťadlách, ale aj zlepšiť zostavenie DA chromofórov.Okrem toho pseudooktaedrická polosendvičová štruktúra organokovových komplexov Ru(II)-arénov môže stericky zabrániť H-agregácii chromofórov typu DA, čím sa uľahčuje tvorba J-agregácie s červenými posunutými absorpčnými pásmi.Avšak inherentné nevýhody komplexov Ru(II)-arén, ako je nízka stabilita a/alebo slabá biologická dostupnosť, môžu ovplyvniť terapeutickú účinnosť a in vivo aktivitu komplexov arén-Ru(II).Štúdie však ukázali, že tieto nevýhody možno prekonať enkapsuláciou komplexov ruténia biokompatibilnými polymérmi fyzikálnou enkapsuláciou alebo kovalentnou konjugáciou.
V tejto práci uvádzame DA-konjugované komplexy Ru (II)-arénu (RuDA) so spúšťačom NIR prostredníctvom koordinačnej väzby medzi chromoforom DAD a skupinou Ru (II)-arénu.Výsledné komplexy sa môžu samovoľne zostaviť do metalosupramolekulárnych vezikúl vo vode v dôsledku nekovalentných interakcií.Je pozoruhodné, že supramolekulárna zostava obdarila RuDA polymerizáciou indukovanými medzisystémovými cross-over vlastnosťami, čo výrazne zvýšilo účinnosť ISC, čo bolo veľmi priaznivé pre PDT (obr. 1A).Na zvýšenie akumulácie nádoru a biokompatibility in vivo sa použil Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) schválený FDA na zapuzdrenie RuDA47,48,49 na vytvorenie nanočastíc RuDA-NP (obrázok 1B), ktoré pôsobili ako vysoko účinné PDT/dvojité režim PTT proxy .Pri fototerapii rakoviny (obrázok 1C) sa RuDA-NP použil na liečbu nahých myší s nádormi MDA-MB-231 na štúdium účinnosti PDT a PTT in vivo.
Schematické znázornenie fotofyzikálneho mechanizmu RuDA v monomérnych a agregovaných formách pre fototerapiu rakoviny, syntéza B RuDA-NP a C RuDA-NP pre NIR-aktivované PDT a PTT.
RuDA, pozostávajúci z funkčnosti TPA a TDP, sa pripravil podľa postupu uvedeného na doplnkovom obrázku 1 (obrázok 2A) a RuDA sa charakterizoval pomocou 1H a 13C NMR spektier, elektrosprejovej ionizačnej hmotnostnej spektrometrie a elementárnej analýzy (doplnkové obrázky 2-4 ).Mapa rozdielu elektrónovej hustoty RuDA najnižšieho singletového prechodu bola vypočítaná časovo závislou teóriou funkcie hustoty (TD-DFT) na štúdium procesu prenosu náboja.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 5, elektrónová hustota sa po fotoexcitácii pohybuje hlavne z trifenylamínu na akceptorovú jednotku TDP, čo možno pripísať typickému prechodu prenosu intramolekulárneho náboja (CT).
Chemická štruktúra rudy B Absorpčné spektrá rudy v zmesiach rôznych pomerov DMF a vody.C Normalizované hodnoty absorpcie RuDA (800 nm) a ICG (779 nm) v závislosti od času pri 0,5 W cm-2 laserového svetla 808 nm.D Fotodegradáciu ABDA indikuje RuDA-indukovaná tvorba 1O2 v zmesiach DMF/H2O s rôznym obsahom vody pôsobením laserového žiarenia s vlnovou dĺžkou 808 nm a výkonom 0,5 W/cm2.
Abstrakt—UV-viditeľná absorpčná spektroskopia bola použitá na štúdium samouskladacích vlastností rudy v zmesiach DMF a vody v rôznych pomeroch.Ako je znázornené na obr.2B, RuDA vykazuje absorpčné pásy od 600 do 900 nm v DMF s maximálnym absorpčným pásom pri 729 nm.Zvyšovanie množstva vody viedlo k postupnému červenému posunu maxima absorpcie rudy na 800 nm, čo naznačuje J-agregáciu rudy v zostavenom systéme.Fotoluminiscenčné spektrá RuDA v rôznych rozpúšťadlách sú znázornené na doplnkovom obrázku 6. Zdá sa, že RuDA vykazuje typickú luminiscenciu NIR-II s maximálnou emisnou vlnovou dĺžkou cca.1050 nm v CH2CI2 a CH30H.Veľký Stokesov posun (asi 300 nm) RuDA naznačuje významnú zmenu v geometrii excitovaného stavu a vznik nízkoenergetických excitovaných stavov.Kvantové výťažky luminiscencie rudy v CH2CI2 a CH30H boli stanovené na 3,3 a 0,6 %.V zmesi metanolu a vody (5/95, obj./obj.) sa však pozoroval mierny červený posun emisie a pokles kvantového výťažku (0,22 %), čo môže byť spôsobené samoskladaním rudy .
Na vizualizáciu samozostavenia ORE sme použili mikroskopiu kvapalnej atómovej sily (AFM) na vizualizáciu morfologických zmien v ORE v metanolovom roztoku po pridaní vody.Keď bol obsah vody pod 80 %, nebola pozorovaná žiadna jasná agregácia (doplnkový obrázok 7).S ďalším zvýšením obsahu vody na 90–95 % sa však objavili malé nanočastice, ktoré naznačovali samoskladanie Ruda.Ožiarenie laserom s vlnovou dĺžkou 808 nm navyše neovplyvnilo intenzitu absorpcie RuDA vo vodnom prostredí. roztoku (obr. 2C a doplnkový obr. 8).Na rozdiel od toho absorbancia indocyanínovej zelene (ICG ako kontrola) rýchlo klesla pri 779 nm, čo naznačuje vynikajúcu fotostabilitu RuDA.Okrem toho sa stabilita RuDA-NP v PBS (pH = 5,4, 7,4 a 9,0), 10 % FBS a DMEM (vysoká hladina glukózy) skúmala pomocou UV-viditeľnej absorpčnej spektroskopie v rôznych časových bodoch.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 9, v PBS pri pH 7,4/9,0, FBS a DMEM boli pozorované mierne zmeny v absorpčných pásoch RuDA-NP, čo naznačuje vynikajúcu stabilitu RuDA-NP.V kyslom prostredí (рН = 5,4) sa však zistila hydrolýza rudy.Ďalej sme hodnotili stabilitu RuDA a RuDA-NP pomocou metód vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC).Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 10, RuDA bol stabilný v zmesi metanolu a vody (50/50, v/v) počas prvej hodiny a hydrolýza bola pozorovaná po 4 hodinách.Pre RuDA NP sa však pozoroval iba široký konkávno-konvexný vrchol.Preto sa na hodnotenie stability RuDA NP v PBS (pH = 7,4) použila gélová permeačná chromatografia (GPC).Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 11, po 8 hodinách inkubácie za testovaných podmienok sa výška píku, šírka píku a plocha píku NP RuDA významne nezmenili, čo naznačuje vynikajúcu stabilitu NP RuDA.Okrem toho snímky TEM ukázali, že morfológia nanočastíc RuDA-NP zostala prakticky nezmenená po 24 hodinách v zriedenom PBS pufri (pH = 7,4, doplnkový obrázok 12).
Pretože samo-zostavenie môže rude poskytnúť rôzne funkčné a chemické vlastnosti, pozorovali sme uvoľňovanie kyseliny 9,10-antracéndiylbis(metylén)dimalónovej (ABDA, indikátor 1O2) v zmesiach metanol-voda.Ruda s rôznym obsahom vody50.Ako je znázornené na obrázku 2D a doplnkovom obrázku 13, nebola pozorovaná žiadna degradácia ABDA, keď bol obsah vody nižší ako 20 %.So zvýšením vlhkosti na 40% došlo k degradácii ABDA, čo dokazuje pokles intenzity fluorescencie ABDA.Bolo tiež pozorované, že vyšší obsah vody vedie k rýchlejšej degradácii, čo naznačuje, že samo-zostavenie RuDA je nevyhnutné a prospešné pre degradáciu ABDA.Tento jav je veľmi odlišný od moderných chromofórov ACQ (agregáciou indukované zhášanie).Pri ožiarení laserom s vlnovou dĺžkou 808 nm je kvantový výťažok 1O2 RuDA v zmesi 98 % H2O/2 % DMF 16,4 %, čo je 82-krát viac ako pri ICG (ΦΔ = 0,2 %)51, demonštruje pozoruhodnú efektívnosť výroby 1O2 RuDA v stave agregácie.
Elektrónové spiny s použitím 2,2,6,6-tetrametyl-4-piperidinónu (TEMP) a 5,5-dimetyl-1-pyrolín-N-oxidu (DMPO) ako spinových pascí Na identifikáciu výsledných druhov sa použila rezonančná spektroskopia (ESR). AFK.od RuDA.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 14, potvrdilo sa, že 102 sa vytvára v časoch ožarovania medzi 0 a 4 minútami.Okrem toho, keď bol RuDA inkubovaný s DMPO za ožarovania, detegoval sa typický štvorriadkový EPR signál 1:2:2:1 aduktu DMPO-OH·, čo naznačuje tvorbu hydroxylových radikálov (OH·).Celkovo vyššie uvedené výsledky demonštrujú schopnosť RuDA stimulovať produkciu ROS prostredníctvom duálneho procesu fotosenzibilizácie typu I/II.
Na lepšie pochopenie elektronických vlastností RuDA v monomérnych a agregovaných formách sa pomocou metódy DFT vypočítali hraničné molekulárne orbitály RuDA v monomérnych a dimérnych formách.Ako je znázornené na obr.3A, najvyšší obsadený molekulárny orbitál (HOMO) monomérneho RuDA je delokalizovaný pozdĺž kostry ligandu a najnižší neobsadený molekulárny orbitál (LUMO) je centrovaný na TDP akceptorovej jednotke.Naopak, hustota elektrónov v dimérnej HOMO je sústredená na ligand jednej molekuly RuDA, zatiaľ čo hustota elektrónov v LUMO je sústredená hlavne na akceptorovú jednotku inej molekuly RuDA, čo naznačuje, že RuDA je v diméri.Vlastnosti CT.
A HOMO a LUMO rudy sú vypočítané v monomérnych a dimérnych formách.B Singletové a tripletové energetické hladiny rudy v monoméroch a diméroch.C Odhadované hladiny RuDA a možných ISC kanálov ako monomérne C a dimérne D. Šípky označujú možné ISC kanály.
Distribúcia elektrónov a dier v nízkoenergetických singletových excitovaných stavoch RuDA v monomérnej a dimérnej forme bola analyzovaná pomocou softvéru Multiwfn 3.852.53, ktoré boli vypočítané pomocou metódy TD-DFT.Ako je uvedené na dodatočnom štítku.Ako je znázornené na obrázkoch 1-2, monomérne diery RDA sú väčšinou delokalizované pozdĺž hlavného reťazca ligandu v týchto singletových excitovaných stavoch, zatiaľ čo elektróny sú väčšinou umiestnené v skupine TDP, čo demonštruje intramolekulárne charakteristiky CT.Okrem toho pre tieto singletové excitované stavy existuje viac-menej prekrytie medzi dierami a elektrónmi, čo naznačuje, že tieto singletové excitované stavy do určitej miery prispievajú k lokálnej excitácii (LE).Pokiaľ ide o diméry, okrem intramolekulárnych CT a LE znakov sa v príslušných stavoch pozoroval určitý podiel intermolekulárnych CT znakov, najmä S3, S4, S7 a S8, na základe intermolekulárnej CT analýzy, s CT intermolekulárnymi prechodmi ako hlavnými (Doplnková tabuľka).3).
Aby sme lepšie porozumeli experimentálnym výsledkom, ďalej sme skúmali vlastnosti excitovaných stavov RuDA, aby sme preskúmali rozdiely medzi monomérmi a dimérmi (doplnkové tabuľky 4–5).Ako je znázornené na obrázku 3B, energetické hladiny singletových a tripletových excitovaných stavov diméru sú oveľa hustejšie ako hladiny monoméru, čo pomáha znižovať energetickú medzeru medzi S1 a Tn. Uvádza sa, že prechody ISC by sa mohli realizovať v rámci malej energetickej medzery (ΔES1-Tn < 0,3 eV) medzi S1 a Tn54. Uvádza sa, že prechody ISC by sa mohli realizovať v rámci malej energetickej medzery (ΔES1-Tn < 0,3 eV) medzi S1 a Tn54. Сообщалось, что перероды ISC могут ыть реованы в пределах неболшш эжовеской щели (ΔES1-tn <0.3 эж э 5 и4 и. Uvádza sa, že prechody ISC možno realizovať v rámci malej energetickej medzery (ΔES1-Tn <0, 3 eV) medzi S1 a Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что перерод isc может ыть реализован в пределах неболшолшой эжжетической щели (ΔES1-tn <0,3 эж эж э 5 у 5 у 5 у 5 у 5 у 5 у 5 у 5 у 5. Uvádza sa, že prechod ISC možno realizovať v rámci malej energetickej medzery (ΔES1-Tn < 0,3 eV) medzi S1 a Tn54.Okrem toho iba jeden orbitál, obsadený alebo neobsadený, sa musí líšiť vo viazaných singletových a tripletových stavoch, aby poskytol nenulový integrál SOC.Na základe analýzy excitačnej energie a orbitálneho prechodu sú teda všetky možné kanály prechodu ISC znázornené na obr.3C,D.V monoméri je k dispozícii iba jeden kanál ISC, zatiaľ čo dimérna forma má štyri kanály ISC, ktoré môžu zlepšiť prechod ISC.Preto je rozumné predpokladať, že čím viac molekúl RuDA je agregovaných, tým dostupnejšie budú ISC kanály.Agregáty RuDA preto môžu vytvárať dvojpásmové elektronické štruktúry v singletových a tripletových stavoch, čím sa znižuje energetická medzera medzi S1 a dostupným Tn, čím sa zvyšuje účinnosť ISC na uľahčenie generovania 1O2.
Na ďalšie objasnenie základného mechanizmu sme syntetizovali referenčnú zlúčeninu komplexu arén-Ru(II) (RuET) nahradením dvoch etylových skupín dvoma trifenylamínovými fenylovými skupinami v RuDA (obr. 4A, pre úplnú charakterizáciu pozri ESI, doplnok 15 -21 ) Od donoru (dietylamín) po akceptor (TDF) má RuET rovnaké intramolekulárne CT charakteristiky ako RuDA.Ako sa očakávalo, absorpčné spektrum RuET v DMF vykazovalo pásmo prenosu náboja s nízkou energiou so silnou absorpciou v blízkej infračervenej oblasti v oblasti 600–1100 nm (obr. 4B).Okrem toho bola so zvyšujúcim sa obsahom vody pozorovaná aj agregácia RuET, čo sa prejavilo červeným posunom absorpčného maxima, čo bolo ďalej potvrdené zobrazením tekutým AFM (doplnkový obrázok 22).Výsledky ukazujú, že RuET, podobne ako RuDA, môže vytvárať intramolekulárne stavy a samo sa zostavovať do agregovaných štruktúr.
Chemická štruktúra RuET.B Absorpčné spektrá RuET v zmesiach rôznych pomerov DMF a vody.Pozemky C EIS Nyquist pre RuDA a RuET.Fotoprúdové odozvy D RuDA a RuET pri pôsobení laserového žiarenia s vlnovou dĺžkou 808 nm.
Fotodegradácia ABDA v prítomnosti RuET bola hodnotená ožiarením laserom s vlnovou dĺžkou 808 nm.Prekvapivo nebola pozorovaná žiadna degradácia ABDA v rôznych vodných frakciách (doplnkový obrázok 23).Možným dôvodom je, že RuET nemôže efektívne vytvárať pásikovú elektronickú štruktúru, pretože etylový reťazec nepodporuje efektívny prenos medzimolekulového náboja.Preto sa uskutočnila elektrochemická impedančná spektroskopia (EIS) a prechodné merania fotoprúdu na porovnanie fotoelektrochemických vlastností RuDA a RuET.Podľa Nyquistovho grafu (obrázok 4C) vykazuje RuDA oveľa menší polomer ako RuET, čo znamená, že RuDA56 má rýchlejší medzimolekulový transport elektrónov a lepšiu vodivosť.Okrem toho, hustota fotoprúdu RuDA je oveľa vyššia ako hustota RuET (obr. 4D), čo potvrdzuje lepšiu účinnosť prenosu náboja RuDA57.Fenylová skupina trifenylamínu v rude teda hrá dôležitú úlohu pri poskytovaní medzimolekulového prenosu náboja a vytváraní pásikovej elektronickej štruktúry.
Na zvýšenie akumulácie nádoru a biokompatibility in vivo sme ďalej zapuzdreli RuDA s F127.Priemerný hydrodynamický priemer RuDA-NP bol stanovený na 123,1 nm s úzkou distribúciou (PDI = 0,089) pomocou metódy dynamického rozptylu svetla (DLS) (obrázok 5A), ktorá podporovala akumuláciu nádoru zvýšením permeability a retencie.EPR) efekt.Obrázky TEM ukázali, že Ore NP majú jednotný sférický tvar s priemerným priemerom 86 nm.Je pozoruhodné, že absorpčné maximum RuDA-NP sa objavilo pri 800 nm (doplnkový obrázok 24), čo naznačuje, že RuDA-NP si môžu zachovať funkcie a vlastnosti samozostavujúcich sa RuDA.Vypočítaný kvantový výťažok ROS pre NP Ore je 15,9 %, čo je porovnateľné s Ore Fototermálne vlastnosti RuDA NP boli študované pri pôsobení laserového žiarenia s vlnovou dĺžkou 808 nm pomocou infračervenej kamery.Ako je znázornené na obr.5B, C, kontrolná skupina (len PBS) zaznamenala mierne zvýšenie teploty, zatiaľ čo teplota roztoku RuDA-NPs sa rýchlo zvýšila so zvyšujúcou sa teplotou (AT) na 15, 5, 26, 1 a 43, 0 ° C.Vysoké koncentrácie boli 25, 50 a 100 uM, čo naznačuje silný fototermálny účinok RuDA NP.Okrem toho sa uskutočnili merania cyklu zahrievania/chladenia na vyhodnotenie fototermálnej stability RuDA-NP a porovnanie s ICG.Teplota rudných NP sa po piatich cykloch ohrevu/chladenia neznížila (obr. 5D), čo svedčí o vynikajúcej fototermálnej stabilite rudných NP.Na rozdiel od toho ICG vykazuje nižšiu fototermickú stabilitu, ako je zrejmé zo zjavného vymiznutia fototermálnej teplotnej plošiny za rovnakých podmienok.Podľa predchádzajúcej metódy58 bola účinnosť fototermálnej konverzie (PCE) RuDA-NP vypočítaná ako 24,2 %, čo je viac ako u existujúcich fototermálnych materiálov, ako sú zlaté nanorúty (21,0 %) a zlaté nanoškrupiny (13,0 %)59.NP Ore teda vykazuje vynikajúce fototermálne vlastnosti, čo z nich robí sľubné PTT činidlá.
Analýza DLS a TEM obrazov RuDA NP (vložka).B Tepelné snímky rôznych koncentrácií RuDA NP vystavených laserovému žiareniu pri vlnovej dĺžke 808 nm (0,5 W cm-2).C Fototermálne konverzné krivky rôznych koncentrácií rudných NP, ktoré sú kvantitatívnymi údajmi.B. D Zvýšenie teploty ORE NP a ICG počas 5 cyklov ohrevu a chladenia.
Fotocytotoxicita RuDA NP proti MDA-MB-231 ľudským bunkám rakoviny prsníka bola hodnotená in vitro.Ako je znázornené na obr.6A, B, RuDA-NP a RuDA vykazovali zanedbateľnú cytotoxicitu v neprítomnosti ožiarenia, čo znamená nižšiu toxicitu RuDA-NP a RuDA v tme.Po vystavení laserovému žiareniu pri vlnovej dĺžke 808 nm však RuDA a RuDA NP vykazovali silnú fotocytotoxicitu voči rakovinovým bunkám MDA-MB-231 s hodnotami IC50 (polovičná maximálna inhibičná koncentrácia) 5,4 a 9,4 μM, čo dokazuje že RuDA-NP a RuDA majú potenciál pre fototerapiu rakoviny.Okrem toho sa fotocytotoxicita RuDA-NP a RuDA ďalej skúmala v prítomnosti vitamínu C (Vc), lapača ROS, aby sa objasnila úloha ROS v cytotoxicite vyvolanej svetlom.Je zrejmé, že životaschopnosť buniek sa po pridaní Vc zvýšila a hodnoty IC50 RuDA a RuDA NP boli 25, 7 a 40, 0 μM, čo dokazuje dôležitú úlohu ROS vo fotocytotoxicite RuDA a RuDA NP.Svetlom indukovaná cytotoxicita RuDA-NP a RuDA v rakovinových bunkách MDA-MB-231 farbením živých/mŕtvych buniek pomocou kalceínu AM (zelená fluorescencia pre živé bunky) a propídiumjodidu (PI, červená fluorescencia pre mŕtve bunky).potvrdené bunkami) ako fluorescenčné sondy.Ako je znázornené na obrázku 6C, bunky ošetrené RuDA-NP alebo RuDA zostali životaschopné bez ožiarenia, čo dokazuje intenzívna zelená fluorescencia.Naopak, pri laserovom ožiarení bola pozorovaná iba červená fluorescencia, čo potvrdzuje efektívnu fotocytotoxicitu RuDA alebo RuDA NP.Je pozoruhodné, že po pridaní Vc sa objavila zelená fluorescencia, čo naznačuje porušenie fotocytotoxicity RuDA a RuDA NP.Tieto výsledky sú v súlade s in vitro testami fotocytotoxicity.
Životaschopnosť buniek A RuDA- a B RuDA-NP v bunkách MDA-MB-231 závislá od dávky v prítomnosti alebo neprítomnosti Vc (0,5 mM).Chybové úsečky, priemer ± štandardná odchýlka (n = 3). Nepárové, obojstranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Nepárové, obojstranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvojstranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvojstranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.C Analýza farbenia živých/mŕtvych buniek s použitím kalceínu AM a propídiumjodidu ako fluorescenčných sond.Mierka: 30 µm.Sú znázornené reprezentatívne obrázky troch biologických opakovaní z každej skupiny.D Konfokálne fluorescenčné obrazy produkcie ROS v bunkách MDA-MB-231 za rôznych podmienok liečby.Zelená fluorescencia DCF indikuje prítomnosť ROS.Ožarujte laserom s vlnovou dĺžkou 808 nm s výkonom 0,5 W/cm2 po dobu 10 minút (300 J/cm2).Mierka: 30 µm.Sú znázornené reprezentatívne obrázky troch biologických opakovaní z každej skupiny.E Prietoková cytometria Analýza ošetrenia RuDA-NP (50 uM) alebo RuDA (50 uM) s 808 nm laserom alebo bez neho (0,5 W cm-2) v prítomnosti a neprítomnosti Vc (0,5 mM) počas 10 minút.Sú znázornené reprezentatívne obrázky troch biologických opakovaní z každej skupiny.F Nrf-2, HSP70 a HO-1 buniek MDA-MB-231 ošetrených RuDA-NP (50 uM) s alebo bez laserového ožiarenia 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), bunky exprimujú 2).Sú znázornené reprezentatívne obrázky dvoch biologických opakovaní z každej skupiny.
Intracelulárna produkcia ROS v bunkách MDA-MB-231 sa skúmala pomocou metódy farbenia 2,7-dichlórdihydrofluoresceín diacetátom (DCFH-DA).Ako je znázornené na obr.6D, bunky ošetrené RuDA-NP alebo RuDA vykazovali zreteľnú zelenú fluorescenciu, keď boli ožiarené laserom 808 nm, čo naznačuje, že RuDA-NP a RuDA majú účinnú schopnosť generovať ROS.Naopak, v neprítomnosti svetla alebo v prítomnosti Vc bol pozorovaný len slabý fluorescenčný signál buniek, čo naznačovalo miernu tvorbu ROS.Intracelulárne hladiny ROS v bunkách RuDA-NP a bunkách MDA-MB-231 ošetrených RuDA boli ďalej stanovené prietokovou cytometriou.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 25, priemerná intenzita fluorescencie (MFI) generovaná RuDA-NP a RuDA pod laserovým ožiarením 808 nm sa významne zvýšila asi 5,1 a 4,8 krát v porovnaní s kontrolnou skupinou, čo potvrdzuje ich vynikajúcu tvorbu AFK.kapacita.Intracelulárne hladiny ROS v bunkách RuDA-NP alebo MDA-MB-231 ošetrených RuDA však boli porovnateľné iba s kontrolami bez laserového ožiarenia alebo v prítomnosti Vc, podobne ako výsledky konfokálnej fluorescenčnej analýzy.
Ukázalo sa, že mitochondrie sú hlavným cieľom komplexov Ru(II)-arén60.Preto sa skúmala subcelulárna lokalizácia RuDA a RuDA-NP.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 26, RuDA a RuDA-NP vykazujú podobné profily bunkovej distribúcie s najvyššou akumuláciou v mitochondriách (62,5 ± 4,3 a 60,4 ± 3,6 ng / mg proteínu).V jadrových frakciách rudy a NP rudy sa však našlo len malé množstvo Ru (3,5 a 2,1 %).Zvyšná bunková frakcia obsahovala zvyškové ruténium: 31,7 % (30,6 ± 3,4 ng/mg proteínu) pre RuDA a 42,9 % (47,2 ± 4,5 ng/mg proteínu) pre RuDA-NP.Vo všeobecnosti sa ruda a NP ruda akumulujú hlavne v mitochondriách.Na posúdenie mitochondriálnej dysfunkcie sme použili farbenie JC-1 a MitoSOX Red na posúdenie potenciálu mitochondriálnej membrány a kapacity produkcie superoxidu.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 27, intenzívna zelená (JC-1) a červená (MitoSOX Red) fluorescencia sa pozorovala v bunkách ošetrených RuDA aj RuDA-NP pod laserovým ožiarením 808 nm, čo naznačuje, že RuDA aj RuDA-NP sú vysoko fluorescenčné Dokáže účinne vyvolať depolarizáciu mitochondriálnej membrány a produkciu superoxidu.Okrem toho sa mechanizmus bunkovej smrti určil pomocou analýzy anexín V-FITC/propídium jodid (PI) založenej na prietokovej cytometrii.Ako je znázornené na obrázku 6E, pri ožiarení laserom 808 nm RuDA a RuDA-NP indukovali významne zvýšenú rýchlosť skorej apoptózy (dolný pravý kvadrant) v bunkách MDA-MB-231 v porovnaní s PBS alebo PBS plus laser.spracované bunky.Keď sa však pridal Vc, miera apoptózy RuDA a RuDA-NP sa významne znížila z 50, 9 % a 52, 0 % na 15, 8 % a 17, 8 %, v uvedenom poradí, čo potvrdzuje dôležitú úlohu ROS vo fotocytotoxicite RuDA a RuDA-NP..Okrem toho sa vo všetkých testovaných skupinách (ľavý horný kvadrant) pozorovali mierne nekrotické bunky, čo naznačuje, že apoptóza môže byť prevládajúcou formou bunkovej smrti indukovanej RuDA a RuDA-NP.
Pretože poškodenie oxidačným stresom je hlavným determinantom apoptózy, jadrový faktor spojený s erytroidným 2, faktorom 2 (Nrf2) 62, kľúčovým regulátorom antioxidačného systému, bol skúmaný v MDA-MB-231 ošetrenom RuDA-NPs.Mechanizmus účinku RuDA NP vyvolaný ožiarením.Súčasne bola detegovaná aj expresia downstream proteínovej hemoxygenázy 1 (HO-1).Ako je znázornené na obrázku 6F a doplnkovom obrázku 29, fototerapia sprostredkovaná RuDA-NP zvýšila hladiny expresie Nrf2 a HO-1 v porovnaní so skupinou PBS, čo naznačuje, že RuDA-NP môžu stimulovať signálne dráhy oxidačného stresu.Okrem toho sa na štúdium fototermálneho účinku RuDA-NPs63 hodnotila aj expresia proteínu tepelného šoku Hsp70.Je zrejmé, že bunky ošetrené laserovým ožiarením RuDA-NP + 808 nm vykazovali zvýšenú expresiu Hsp70 v porovnaní s ďalšími dvoma skupinami, čo odráža bunkovú odpoveď na hypertermiu.
Pozoruhodné výsledky in vitro nás podnietili preskúmať in vivo výkon RuDA-NP u nahých myší s nádormi MDA-MB-231.Tkanivová distribúcia RuDA NP bola študovaná stanovením obsahu ruténia v pečeni, srdci, slezine, obličkách, pľúcach a nádoroch.Ako je znázornené na obr.7A, maximálny obsah NP v normálnych orgánoch sa objavil v prvom čase pozorovania (4 hodiny), zatiaľ čo maximálny obsah bol stanovený v nádorových tkanivách 8 hodín po injekcii, pravdepodobne v dôsledku NP v rudách.EPR efekt LF.Podľa výsledkov distribúcie bolo optimálne trvanie liečby NP rudou prijaté 8 hodín po podaní.Na ilustráciu procesu akumulácie RuDA-NP v miestach nádoru sa monitorovali fotoakustické (PA) vlastnosti RuDA-NP zaznamenávaním signálov PA RuDA-NP v rôznych časoch po injekcii.Najprv sa hodnotil PA signál RuDA-NP in vivo zaznamenaním PA obrazov miesta nádoru po intratumorálnej injekcii RuDA-NP.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 30, RuDA-NP vykazovali silný signál PA a existovala pozitívna korelácia medzi koncentráciou RuDA-NP a intenzitou signálu PA (doplnkový obrázok 30A).Potom sa in vivo PA obrazy nádorových miest zaznamenali po intravenóznej injekcii RuDA a RuDA-NP v rôznych časových bodoch po injekcii.Ako je znázornené na obrázku 7B, signál PA RuDA-NP z miesta nádoru sa s časom postupne zvyšoval a dosiahol plató 8 hodín po injekcii, čo je v súlade s výsledkami tkanivovej distribúcie stanovenými analýzou ICP-MS.Pokiaľ ide o RuDA (doplnkový obrázok 30B), maximálna intenzita signálu PA sa objavila 4 hodiny po injekcii, čo naznačuje rýchlu rýchlosť vstupu RuDA do nádoru.Okrem toho sa skúmalo vylučovacie správanie RuDA a RuDA-NP stanovením množstva ruténia v moči a stolici pomocou ICP-MS.Hlavná cesta eliminácie pre RuDA (doplnkový obrázok 31) a RuDA-NP (obrázok 7C) je cez stolicu a počas 8-dňového obdobia štúdie sa pozoroval účinný klírens RuDA a RuDA-NP, čo znamená, že RuDA a RuDA-NP môžu účinne eliminovať z tela bez dlhodobej toxicity.
A. Ex vivo distribúcia RuDA-NP v myšacích tkanivách bola určená obsahom Ru (percento podanej dávky Ru (ID) na gram tkaniva) v rôznych časoch po injekcii.Údaje sú priemer ± štandardná odchýlka (n = 3). Nepárové, obojstranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Nepárové, obojstranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvojstranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvojstranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.B PA snímky in vivo nádorových miest pri excitácii 808 nm po intravenóznom podaní RuDA-NP (10 umol kg-1) v rôznych časových bodoch.Po intravenóznom podaní RuDA NP (10 µmol kg-1) sa C Ru vylučoval z myší močom a stolicou v rôznych časových intervaloch.Údaje sú priemer ± štandardná odchýlka (n = 3).
Vyhrievacia kapacita RuDA-NP in vivo bola študovaná na nahých myšiach s nádormi MDA-MB-231 a RuDA na porovnanie.Ako je znázornené na obr.8A a doplnkový obrázok 32, kontrolná (fyziologický roztok) skupina vykazovala menšiu zmenu teploty (AT ≈ 3 °C) po 10 minútach nepretržitej expozície.Teplota RuDA-NP a RuDA sa však rýchlo zvýšila s maximálnymi teplotami 55, 2 a 49, 9 ° C, čo poskytuje dostatočnú hypertermiu na in vivo terapiu rakoviny.Pozorované zvýšenie vysokej teploty pre RuDA NP (ΔT ≈ 24 °C) v porovnaní s RuDA (ΔT ≈ 19 °C) môže byť spôsobené jeho lepšou permeabilitou a akumuláciou v nádorových tkanivách v dôsledku EPR efektu.
Infračervené tepelné snímky myší s nádormi MDA-MB-231 ožiarených 808 nm laserom v rôznych časoch 8 hodín po injekcii.Sú znázornené reprezentatívne obrázky štyroch biologických opakovaní z každej skupiny.B Relatívny objem nádoru a C Priemerná hmotnosť nádoru rôznych skupín myší počas liečby.D Krivky telesnej hmotnosti rôznych skupín myší.Ožarujte laserom s vlnovou dĺžkou 808 nm s výkonom 0,5 W/cm2 po dobu 10 minút (300 J/cm2).Chybové úsečky, priemer ± štandardná odchýlka (n = 3). Nepárové, obojstranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Nepárové, obojstranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvojstranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvojstranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001. E H&E farbiace obrazy hlavných orgánov a nádorov z rôznych liečebných skupín, vrátane skupín fyziologický roztok, fyziologický roztok + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP a RuDA-NP + laser. E H&E farbiace obrazy hlavných orgánov a nádorov z rôznych liečebných skupín, vrátane skupín fyziologický roztok, fyziologický roztok + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP a RuDA-NP + laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H&E farbiace obrazy hlavných orgánov a nádorov z rôznych liečebných skupín, vrátane fyziologického roztoku, fyziologického roztoku + laseru, RuDA, RuDA + lasera, RuDA-NP a RuDA-NP + laserových skupín.„来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E H&E farbenie hlavných orgánov a nádorov z rôznych liečebných skupín vrátane fyziologického roztoku, fyziologického roztoku + laseru, RuDA, RuDA + lasera, RuDA-NP a RuDA-NP + lasera.Mierka: 60 µm.
Bol hodnotený účinok fototerapie in vivo s RuDA a RuDA NP, pri ktorej boli nahým myšiam s nádormi MDA-MB-231 intravenózne injikované RuDA alebo RuDA NP v jednej dávke 10,0 µmol kg-1 cez chvostovú žilu a potom 8 hodiny po injekcii.laserové ožarovanie s vlnovou dĺžkou 808 nm.Ako je znázornené na obrázku 8B, objemy nádorov sa významne zvýšili v skupinách s fyziologickým roztokom a laserom, čo naznačuje, že ožarovanie fyziologickým roztokom alebo laserom 808 malo malý vplyv na rast nádoru.Rovnako ako v skupine s fyziologickým roztokom bol tiež pozorovaný rýchly rast nádoru u myší liečených RuDA-NP alebo RuDA v neprítomnosti laserového ožarovania, čo dokazuje ich nízku toxicitu v tme.Na rozdiel od toho, po laserovom ožiarení liečba RuDA-NP aj RuDA vyvolala významnú regresiu nádoru so znížením objemu nádoru o 95,2 % a 84,3 %, v tomto poradí, v porovnaní so skupinou liečenou fyziologickým roztokom, čo naznačuje vynikajúcu synergickú PDT., sprostredkované RuDA/CHTV efektom.– NP alebo Ore V porovnaní s RuDA vykazovali RuDA NP lepší fototerapeutický účinok, čo bolo spôsobené najmä EPR účinkom RuDA NP.Výsledky inhibície rastu nádoru boli ďalej hodnotené vyrezaním hmotnosti nádoru v deň 15 liečby (obr. 8C a doplnkový obrázok 33).Priemerná hmotnosť nádoru u myší liečených RuDA-NP a myší liečených RuDA bola 0,08 a 0,27 g, v danom poradí, čo bolo oveľa ľahšie ako v kontrolnej skupine (1,43 g).
Okrem toho sa každé tri dni zaznamenávala telesná hmotnosť myší, aby sa študovala temná toxicita RuDA-NP alebo RuDA in vivo.Ako je znázornené na obrázku 8D, u všetkých liečebných skupín neboli pozorované žiadne významné rozdiely v telesnej hmotnosti. Okrem toho sa vykonalo farbenie hlavných orgánov (srdce, pečeň, slezina, pľúca a obličky) z rôznych liečebných skupín hematoxylínom a eozínom (H&E). Ďalej sa uskutočnilo farbenie hlavných orgánov (srdce, pečeň, slezina, pľúca a obličky) z rôznych liečebných skupín hematoxylínom a eozínom (H&E). Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Okrem toho sa vykonalo farbenie hlavných orgánov (srdce, pečeň, slezina, pľúca a obličky) z rôznych liečebných skupín hematoxylínom a eozínom (H&E).此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏剌肾脏）ゾ脏）进行一仌伉、行蓼岏您行行蓼官报 (H&E) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Okrem toho sa v rôznych liečebných skupinách uskutočnilo farbenie hlavných orgánov (srdce, pečeň, slezina, pľúca a obličky) hematoxylínom a eozínom (H&E).Ako je znázornené na obr.8E, obrazy H&E farbenia piatich hlavných orgánov zo skupín RuDA-NP a RuDA nevykazujú žiadne zjavné abnormality alebo poškodenia orgánov. 8E, obrazy H&E farbenia piatich hlavných orgánov zo skupín RuDA-NP a RuDA nevykazujú žiadne zjavné abnormality alebo poškodenia orgánov.Ako je znázornené na obr.8e, изображения окрашивания h & e пяи осых органов з з групví ruda-nps и ruda демонстрир pia. 8E, H&E sfarbené obrázky piatich hlavných orgánov zo skupín RuDA-NP a RuDA nevykazujú žiadne zjavné orgánové abnormality alebo lézie.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有娘示凟嘚嘸戼夼显示椼嘚悼如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8e, ззображения окрашивания H & e птти ос иа иуыхзззуууууууууууууан и Ruda и. Ako je znázornené na obrázku 8E, snímky H&E farbenia piatich hlavných orgánov zo skupín RuDA-NP a RuDA nevykazovali žiadne zjavné abnormality alebo poškodenie orgánov.Tieto výsledky ukázali, že ani RuDA-NP, ani RuDA nevykazovali známky toxicity in vivo. Okrem toho snímky nádorov zafarbené H&E ukázali, že skupiny RuDA + Laser a RuDA-NP + Laser by mohli spôsobiť závažnú deštrukciu rakovinových buniek, čo dokazuje vynikajúcu in vivo fototerapeutickú účinnosť RuDA a RuDA-NP. Okrem toho snímky nádorov zafarbené H&E ukázali, že skupiny RuDA + Laser a RuDA-NP + Laser by mohli spôsobiť závažnú deštrukciu rakovinových buniek, čo dokazuje vynikajúcu in vivo fototerapeutickú účinnosť RuDA a RuDA-NP.Okrem toho snímky nádorov zafarbené hematoxylínom-eozínom ukázali, že skupiny RuDA+Laser aj RuDA-NPs+Laser môžu vyvolať závažnú deštrukciu rakovinových buniek, čo dokazuje vynikajúcu fototerapeutickú účinnosť RuDA a RuDA-NP in vivo.此外 ， 肿瘤 的 h & e 染色 图像 显示 ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 严重 的 破坏 ， ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 优异 光疗 功效。。。。。。。。。。。此外 ， “ ...Okrem toho snímky nádorov zafarbené hematoxylínom a eozínom ukázali, že skupiny RuDA+Laser aj RuDA-NPs+Laser viedli k závažnej deštrukcii rakovinových buniek, čo dokazuje vynikajúcu fototerapeutickú účinnosť RuDA a RuDA-NP in vivo.
Záverom možno povedať, že organokovový komplex Ru(II)-arén (RuDA) s ligandami typu DA bol navrhnutý na uľahčenie procesu ISC pomocou agregačnej metódy.Syntetizovaný RuDA sa môže samozostavovať prostredníctvom nekovalentných interakcií, aby vytvoril supramolekulárne systémy odvodené od RuDA, čím uľahčuje tvorbu 1O2 a účinnú fototermálnu konverziu na liečbu rakoviny vyvolanú svetlom.Je pozoruhodné, že monomérny RuDA nevygeneroval 1O2 pri laserovom ožiarení pri 808 nm, ale mohol generovať veľké množstvo 1O2 v agregovanom stave, čo demonštruje racionalitu a účinnosť nášho návrhu.Následné štúdie ukázali, že supramolekulárna zostava dáva RuDA zlepšené fotofyzikálne a fotochemické vlastnosti, ako je absorpcia červeného posunu a odolnosť voči fotobieleniu, ktoré sú veľmi žiaduce pre spracovanie PDT a PTT.Experimenty in vitro aj in vivo ukázali, že RuDA NP s dobrou biokompatibilitou a dobrou akumuláciou v nádore vykazujú vynikajúcu protirakovinovú aktivitu indukovanú svetlom po ožiarení laserom pri vlnovej dĺžke 808 nm.RuDA NP ako účinné bimodálne supramolekulárne PDT / PTW činidlá teda obohatia sadu fotosenzibilizátorov aktivovaných pri vlnových dĺžkach nad 800 nm.Koncepčný dizajn supramolekulárneho systému poskytuje účinnú cestu pre fotosenzibilizátory aktivované NIR s vynikajúcimi fotosenzibilizačnými účinkami.
Všetky chemikálie a rozpúšťadlá boli získané od komerčných dodávateľov a použité bez ďalšieho čistenia.RuCl3 bol zakúpený od Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Čína).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolín-5,6-dión) a 4,7-bis[4-(N,N-difenylamino)fenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol bol syntetizovaný podľa predchádzajúcich štúdií64,65.NMR spektrá boli zaznamenané na spektrometri Bruker Avance III-HD 600 MHz v analytickom testovacom centre Southeastern University s použitím d6-DMSO alebo CDCI3 ako rozpúšťadla.Chemické posuny 5 sú uvedené v ppm.vzhľadom na tetrametylsilán a interakčné konštanty J sú uvedené v absolútnych hodnotách v hertzoch.Hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (HRMS) sa uskutočnila na prístroji Agilent 6224 ESI/TOF MS.Elementárna analýza C, H a N sa uskutočnila na elementárnom analyzátore Vario MICROCHNOS (Elementar).UV-viditeľné spektrá sa merali na spektrofotometri Shimadzu UV3600.Fluorescenčné spektrá boli zaznamenané na spektrofluorimetri Shimadzu RF-6000.EPR spektrá boli zaznamenané na prístroji Bruker EMXmicro-6/1.Morfológia a štruktúra pripravených vzoriek bola študovaná na prístrojoch FEI Tecnai G20 (TEM) a Bruker Icon (AFM) pracujúcich pri napätí 200 kV.Dynamický rozptyl svetla (DLS) sa uskutočnil na analyzátore Nanobrook Omni (Brookhaven).Fotoelektrochemické vlastnosti boli merané na elektrochemickom zariadení (CHI-660, Čína).Fotoakustické snímky boli získané pomocou systému FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Konfokálne snímky sa získali pomocou konfokálneho mikroskopu Olympus FV3000.Analýza FACS sa uskutočnila na prietokovom cytometri BD Calibur.Experimenty vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) sa uskutočnili na systéme Waters Alliance e2695 s použitím detektora 2489 UV/Vis.Testy gélovej permeačnej chromatografie (GPC) boli zaznamenané na prístroji Thermo ULTIMATE 3000 s použitím detektora indexu lomu ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolín-5,6-dión)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4-(N, N-difenylamino)fenyl]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) a ľadová kyselina octová (30 ml) sa miešali pri teplote spätného toku v chladničke počas 12 hodín.Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu použitím rotačnej odparky.Výsledný zvyšok sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou (silikagél, CH2CI2:MeOH = 20:1), čím sa získal RuDA ako zelený prášok (výťažok: 877,5 mg, 80 %).konečník.Vypočítané pre C64H48CI2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Nájdené: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 5 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), δ (ppm) 158,03, 152,81, 149,31, 147,98, 147,98, 139,98, 136,21, 135,57, 134,68, 130,34, 1209, 103,86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 1097,25.
Syntéza 4,7-bis[4-(N,N-dietylamino)fenyl-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazolu (L2): L2 sa syntetizoval v dvoch krokoch.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) sa pridal k N,N-dietyl-4-(tributylstannyl)anilínu (1,05 g, 2,4 mmol) a 4,7-dibróm-5,6-dinitro roztoku - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) v suchom toluéne (100 ml).Zmes sa miešala pri 100 °C počas 24 hodín.Po odstránení toluénu vo vákuu sa výsledná tuhá látka premyla petroléterom.Potom sa zmes tejto zlúčeniny (234,0 mg, 0,45 mmol) a práškového železa (0,30 g, 5,4 mmol) v kyseline octovej (20 ml) miešala pri 80 °C počas 4 hodín.Reakčná zmes sa naleje do vody a výsledná hnedá pevná látka sa odfiltruje.Produkt sa čistil dvakrát vákuovou sublimáciou, čím sa získala zelená tuhá látka (126,2 mg, 57 % výťažok).konečník.Vypočítané pre C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Nájdené: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H NMR (600 MHz, CDC13), 5 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13C NMR (150 MHz, CDC13), 5 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Zlúčeniny sa pripravili a purifikovali podľa postupov podobných RuDA.konečník.Vypočítané pre C48H48CI2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Zistené: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81. 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H). 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H); 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), Δ (PPM) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,3, 121,4, 124,4.38,06, 31,22, 29,69, 22,29, 19,19, 14,98, 12,93.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 905,24.
RuDA sa rozpustil v MeOH/H20 (5/95, obj./obj.) v koncentrácii 10 uM.Absorpčné spektrum RuDA sa meralo každých 5 minút na spektrofotometri Shimadzu UV-3600 pri ožiarení laserovým svetlom s vlnovou dĺžkou 808 nm (0,5 W/cm2).ICG spektrá boli zaznamenané za rovnakých podmienok ako štandard.
EPR spektrá boli zaznamenané na spektrometri Bruker EMXmicro-6/1 s mikrovlnným výkonom 20 mW, rozsahom snímania 100 G a moduláciou poľa 1 G. 2,2,6,6-tetrametyl-4-piperidón (TEMP) a 5,5-dimetyl-1-pyrolín-N-oxid (DMPO) sa použili ako odstredivé zachytávače.Spektrá elektrónovej spinovej rezonancie boli zaznamenané pre zmiešané roztoky RuDA (50 uM) a TEMF (20 mM) alebo DMPO (20 mM) pri pôsobení laserového žiarenia s vlnovou dĺžkou 808 nm (0,5 W/cm2).
Výpočty DFT a TD-DFT pre RuDA sa uskutočnili na úrovniach PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ vo vodnom roztoku pomocou Gaussovho programu 1666,67,68.HOMO-LUMO, dierové a elektrónové distribúcie nízkoenergetického singletového excitovaného stavu RuDA boli vynesené pomocou programu GaussView (verzia 5.0).
Najprv sme sa pokúsili zmerať účinnosť generovania 1O2 RuDA pomocou konvenčnej UV-viditeľnej spektroskopie s ICG (ΦΔ = 0,002) ako štandardom, ale fotodegradácia ICG silne ovplyvnila výsledky.Kvantový výťažok 102 RuDA sa teda meral detekciou zmeny intenzity fluorescencie ABDA pri asi 428 nm pri ožiarení laserom s vlnovou dĺžkou 808 nm (0,5 W/cm2).Experimenty sa uskutočnili na RuDA a RuDA NP (20 uM) vo vode/DMF (98/2, obj./obj.) s obsahom ABDA (50 uM).Kvantový výťažok 102 sa vypočítal pomocou nasledujúceho vzorca: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS a rICG sú reakčné rýchlosti ABDA s 102 získané z fotosenzibilizátora a ICG.APS a AICG sú absorbancia fotosenzibilizátora a ICG pri 808 nm.
Merania AFM sa uskutočňovali v kvapalných podmienkach s použitím skenovacieho režimu na systéme Bruker Dimension Icon AFM.Použitím otvorenej štruktúry s tekutými bunkami boli bunky dvakrát premyté etanolom a vysušené prúdom dusíka.Vložte vysušené bunky do optickej hlavy mikroskopu.Ihneď kvapnite kvapku vzorky do bazéna s kvapalinou a umiestnite ju na konzolu pomocou sterilnej jednorazovej plastovej striekačky a sterilnej ihly.Ďalšia kvapka sa umiestni priamo na vzorku a keď sa optická hlavica zníži, obe kvapky sa spoja a vytvoria meniskus medzi vzorkou a nádržkou na kvapalinu.Merania AFM sa uskutočňovali pomocou nitridovej konzoly SCANASYST-FLUID v tvare V (Bruker, tvrdosť k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
HPLC chromatogramy sa získali na systéme Waters e2695 vybavenom kolónou fénix C18 (250 x 4,6 mm, 5 um) s použitím detektora 2489 UV/Vis.Vlnová dĺžka detektora je 650 nm.Mobilné fázy A a B boli voda a metanol a prietok mobilnej fázy bol 1,0 ml.min-1.Gradient (rozpúšťadlo B) bol nasledujúci: 100 % od 0 do 4 minút, 100 % až 50 % od 5 do 30 minút a reset na 100 % od 31 do 40 minút.Ruda sa rozpustila v zmiešanom roztoku metanolu a vody (50/50, objemovo) v koncentrácii 50 uM.Objem nástreku bol 20 ul.
GPC testy sa zaznamenávali na prístroji Thermo ULTIMATE 3000 vybavenom dvoma PL kolónami aquagel-OH MIXED-H (2 x 300 x 7,5 mm, 8 um) a detektorom indexu lomu ERC RefratoMax520.GPC kolóna sa eluovala vodou pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min pri 30 °C.Rudné NP boli rozpustené v roztoku PBS (pH = 7,4, 50 μM), injekčný objem bol 20 μl.
Fotoprúdy sa merali na elektrochemickom zariadení (CHI-660B, Čína).Optoelektronické odozvy pri zapnutí a vypnutí lasera (808 nm, 0,5 W/cm2) sa merali pri napätí 0,5 V v čiernej skrinke, resp.Použil sa štandardný trojelektródový článok s elektródou zo skleneného uhlíka v tvare L (GCE) ako pracovnou elektródou, štandardnou kalomelovou elektródou (SCE) ako referenčnou elektródou a platinovým diskom ako protielektródou.Ako elektrolyt sa použil 0,1 M roztok Na2S04.
Bunková línia ľudskej rakoviny prsníka MDA-MB-231 bola zakúpená od KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Čína, katalógové číslo: KG033).Bunky rástli v monovrstvách v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM, vysoká glukóza) doplnenom roztokom 10 % fetálneho bovinného séra (FBS), penicilínom (100 ug/ml) a streptomycínom (100 ug/ml).Všetky bunky sa kultivovali pri 37 °C vo vlhkej atmosfére obsahujúcej 5 % C02.
MTT test sa použil na stanovenie cytotoxicity RuDA a RuDA-NP v prítomnosti a neprítomnosti svetelného žiarenia, s alebo bez Vc (0,5 mM).Rakovinové bunky MDA-MB-231 sa pestovali na 96-jamkových doštičkách pri hustote buniek približne 1 x 105 buniek/ml/jamku a inkubovali sa 12 hodín pri 37,0 °C v atmosfére 5 % C02 a 95 % vzduchu.K bunkám sa pridali RuDA a RuDA NP rozpustené vo vode.Po 12 hodinách inkubácie boli bunky vystavené 0,5 W cm-2 laserovému žiareniu pri vlnovej dĺžke 808 nm počas 10 minút (300 J cm-2) a potom inkubované v tme počas 24 hodín.Bunky sa potom inkubovali s MTT (5 mg/ml) ďalších 5 hodín.Nakoniec zmeňte médium na DMSO (200 ul), aby sa rozpustili výsledné purpurové kryštály formazanu.Hodnoty OD boli merané pomocou čítačky mikrodoštičiek s vlnovou dĺžkou 570/630 nm.Hodnota IC50 pre každú vzorku sa vypočítala pomocou softvéru SPSS z kriviek dávka-odozva získaných z aspoň troch nezávislých experimentov.
Bunky MDA-MB-231 boli ošetrené RuDA a RuDA-NP v koncentrácii 50 uM.Po 12 hodinách inkubácie boli bunky ožiarené laserom s vlnovou dĺžkou 808 nm a výkonom 0,5 W/cm2 počas 10 min (300 J/cm2).V skupine s vitamínom C (Vc) boli bunky ošetrené 0,5 mM Vc pred laserovým ožiarením.Bunky sa potom inkubovali v tme ďalších 24 hodín, potom sa farbili kalceínom AM a propídium jodidom (20 ug/ml, 5 ul) počas 30 minút, potom sa premyli PBS (10 ul, pH 7,4).obrázky zafarbených buniek.