Správy

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Rakovinové bunky si vyvinuli rôzne mechanizmy na prekonanie bunkového stresu a pokračujúci pokrok.Proteínkináza R (PKR) a jej proteínový aktivátor (PACT) sú počiatočnými reagenciami, ktoré monitorujú rôzne stresové signály vedúce k inhibícii bunkovej proliferácie a apoptózy.Regulácia dráhy PACT-PKR v rakovinových bunkách však zostáva do značnej miery neznáma.Tu sme zistili, že dlhá nekódujúca RNA (lncRNA) aspartyl tRNA syntetázová antisense RNA 1 (DARS-AS1) sa priamo podieľa na inhibícii dráhy PACT-PKR a podporuje proliferáciu rakovinových buniek.Pomocou rozsiahleho funkčného skríningu lncRNA spojenej s rakovinou CRISPRi 971 sme zistili, že DARS-AS1 bol spojený s výrazne zvýšenou proliferáciou rakovinových buniek.Preto knockout DARS-AS1 inhibuje bunkovú proliferáciu a podporuje apoptózu rakovinových buniek v rôznych rakovinových bunkových líniách in vitro a významne znižuje rast nádoru in vivo.Mechanicky sa DARS-AS1 viaže priamo na aktivačnú doménu PACT a zabraňuje interakcii PACT-PKR, čím znižuje aktiváciu PKR, fosforyláciu eIF2a a inhibuje apoptotickú bunkovú smrť.Klinicky je DARS-AS1 široko exprimovaný vo viacerých rakovinách a nadmerná expresia tejto lncRNA naznačuje zlú prognózu.Táto štúdia objasňuje rakovinu špecifickú reguláciu PACT-PKR dráhy pomocou DARS-AS1 lncRNA a poskytuje ďalší cieľ pre prognózu a liečbu rakoviny.
Schopnosť prispôsobiť sa stresu je dôležitou charakteristikou prežitia a proliferácie rakovinových buniek.Rýchla proliferácia a metabolické znaky rakoviny vrcholia v drsných mikroprostrediach – nedostatok živín, hypoxia a nízke pH – ktoré môžu spustiť signálne dráhy bunkovej smrti.Pri rakovine sa často pozoruje dysregulácia génov citlivých na stres, ako je p535, proteíny tepelného šoku 6, 7, KRAS8, 9 a HIF-110, 11, 12, 13, čím sa blokuje apoptóza a podporuje sa prežitie.
Proteínkináza R (PKR) je dôležitým senzorom stresu a podjednotkovou kinázou eukaryotického iniciačného faktora 2α (eIF2α), translačného regulátora, ktorý spája bunkový stres s bunkovou smrťou.PKR bol pôvodne identifikovaný ako antivírusový proteín detekciou cudzej dvojvláknovej RNA (dsRNA).Po aktivácii PKR fosforyluje eIF2a, aby inhiboval syntézu vírusových a bunkových proteínov14,15,16.PACT (PKR aktivátorový proteín) bol identifikovaný ako prvý PKR aktivačný proteín v neprítomnosti dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Prostredníctvom priamej interakcie s PKR PACT prenáša rôzne stresy (hladovanie v sére, ošetrenie peroxidom alebo arzenitom) na PKR a následné signálne dráhy.Okrem fosforylácie eIF2α spúšťa PACT-sprostredkovaná aktivácia PKR rôzne udalosti spojené so stresovou reakciou, vrátane zmeneného redoxného stavu prostredníctvom dráhy PI3K/Akt24, zvýšenej kontroly poškodenia DNA prostredníctvom p5325,26 a NF-κB27,28 Reguluje transkripciu, 29. Vzhľadom na ich kritickú úlohu v reakcii na stres, proliferáciu, apoptózu a ďalšie kľúčové bunkové procesy sú PKR a PACT sľubnými terapeutickými cieľmi pre mnohé choroby, najmä rakovinu30, 31, 32, 33.Avšak napriek tomuto pleiotropnému funkčnému a biologickému významu zostáva regulácia aktivity PACT/PKR v rakovinových bunkách nepolapiteľná.
lncRNA sú transkripty väčšie ako 200 nukleotidov bez potenciálu kódovania proteínov.Keďže špičkové projekty sekvenovania celého genómu identifikovali tisíce lncRNA, 35, 36 sa vynaložilo veľké úsilie na objasnenie ich biologických funkcií.Rastúci počet výskumov ukázal, že lncRNA sa podieľajú na mnohých biologických procesoch37 vrátane regulácie inaktivácie X-chromozómov38,39, imprintingu40, transkripcie41,42, translácie43 a dokonca rastu rakoviny44,45,46,47.Tieto štúdie uviedli, že veľa lncRNA sa podieľa na dráhe PACT / PKR.Jedna takáto štúdia ukázala, že lncRNA ASPACT inhibovala transkripciu PACT a zvýšila jadrovú retenciu PACT mRNA.Ďalšie štúdie ukázali, že lncRNA nc886 sa viaže na PKR a inhibuje jeho fosforyláciu49, 50.Doteraz nebola hlásená lncRNA regulujúca PACT sprostredkovanú aktiváciu PKR.
Aspartyl-tRNA syntetázová antisense RNA 1 (DARS-AS1) bola identifikovaná ako onkogénna lncRNA51,52,53,54.Prostredníctvom regulácie miP-194-5p53, miP-12952 a miP-532-3p51 sa ukázalo, že DARS-AS1 podporuje rast karcinómu jasných buniek obličiek, karcinómu štítnej žľazy a nemalobunkového karcinómu pľúc.Tong a kolegovia tiež zistili, že DARS-AS1 podporuje progresiu myelómu udržiavaním stability motívu viažuceho RNA proteínu 39 (RBM39).Neuskutočnili sa však žiadne štúdie o tom, či sa táto lncRNA podieľa na regulácii aktivácie PACT-PKR a stresovej odpovedi rakovinových buniek.
Tu sme vykonali rozsiahly skríning straty funkcie pomocou systému CRISPRi a zistili sme, že DARS-AS1 lncRNA podporuje proliferáciu niekoľkých typov rakovinových buniek.Okrem toho sme identifikovali hlavný mechanizmus: DARS-AS1 sa viaže priamo na PACT, inhibuje väzbu PACT a PKR, zabraňuje fosforylácii eIF2a, nižšieho substrátu PKR, a nakoniec inhibuje apoptotickú bunkovú smrť.Na záver naša práca odhaľuje DARS-AS1 lncRNA ako regulátor dráhy PACT-PKR a potenciálny cieľ liečby a prognózy rakoviny.
Rozsiahle štúdie genómového profilovania identifikovali stovky lncRNA spojených s rakovinou.Ich funkcia však zostáva veľkou neznámou56.Na identifikáciu sľubných kandidátov lncRNA zapojených do progresie rakoviny sme vykonali skríning straty funkcie na zníženú proliferáciu v bunkovej línii kolorektálneho karcinómu SW620 pomocou systému CRISPRi (obr. 1a).Jedinečnou vlastnosťou bunkových línií rakoviny hrubého čreva SW480 a SW620 je to, že pochádzajú z primárnych a sekundárnych nádorov u jedného pacienta.To poskytuje cenné porovnanie pre štúdium genetických zmien v progresii pokročilého karcinómu hrubého čreva.Preto sme analyzovali transkriptómy bunkových línií kolorektálneho karcinómu (SW480 a SW620) pomocou sekvenovania RNA a zozbierali sme niektoré potenciálne funkčné lncRNA z publikovanej literatúry.Na základe týchto výsledkov sme navrhli združenú knižnicu sgRNA obsahujúcu 7355 sgRNA oligo zacielených na 971 lncRNA spojených s rakovinou a 500 necielených sgRNA oligo na negatívnu kontrolu (doplnkové údaje 1).
Schematické znázornenie skríningu pomocou systému CRISPRi.b obohatenie sgRNA po skríningu.Vodorovná bodkovaná čiara predstavuje log2 (násobok zmeny) = ±0,58.Vertikálna bodkovaná čiara označuje hodnotu p = 0,05.Čierne bodky predstavujú necieľovú sgRNA (označenú ako NC).Červené bodky sú sgRNA zacielené na DARS-AS1.Modré bodky sú sgRNA zacielené na LINC00205, predtým opísanú onkogénnu lncRNA.násobná zmena = (normalizovaná hodnota, deň 17)/(normalizovaná hodnota, deň 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown inhiboval rast buniek.Chybové úsečky predstavujú ± štandardnú odchýlku troch experimentov.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dvojstranný Studentov t-test.d Expresia DARS-AS1 v nádoroch (súbor údajov TCGA).em Expresia DARS-AS1 v párových normálnych a nádorových vzorkách od pacientov s BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP a COAD, v tomto poradí (súbor údajov TCGA).p-hodnoty sa získali pomocou párového dvojstranného Studentovho t-testu.
Po skonštruovaní plazmidu a zabalení lentivírusu sme transdukovali bunkovú líniu kolorektálneho karcinómu dCas9-SW620 vyššie uvedenou knižnicou v štyroch nezávislých infekčných experimentoch.Multiplicita infekcie (MOI) pre tieto infekcie bola 0, 1–0, 3, čo naznačuje, že každá bunka môže byť transfekovaná iba jednou sgRNA.Po 18 dňoch kultivácie in vitro sa profil obohatenia cieľových sgRNA po skríningu znížil alebo zvýšil, zatiaľ čo počet necielených kontrolných oligonukleotidov zostal relatívne nezmenený v porovnaní s profilom pred skríningom, čo naznačuje, že náš cieľ má vysoko špecifický skríning. knižnica.Ryža.1b a doplnková tabuľka 1). LINC00205, o ktorom sa predtým uvádzalo, že podporuje rakovinu pľúc a progresiu rakoviny pečene58, 59, 60, bol skrínovaný (log2 (zmena záhybov) < -0,58, hodnota p < 0,05, čo potvrdzuje spoľahlivosť tohto skríningu (obr. 1b). LINC00205, o ktorom sa predtým uvádzalo, že podporuje rakovinu pľúc a progresiu rakoviny pečene58, 59, 60, bol skrínovaný (log2 (zmena záhybov) < -0,58, hodnota p < 0,05, čo potvrdzuje spoľahlivosť tohto skríningu (obr. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, o ktorom sa predtým uvádzalo, že podporuje progresiu rakoviny pľúc a rakoviny pečene58,59,60, bol vylúčený (log2 (násobná zmena) <-0,58, p-hodnota <0,05, čo potvrdzuje robustnosť tohto skríningu (obr. .1b). . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 掉 （（（倍数）） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 了 该 筛选 的 可靠性 图 图 1B Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 掉 （（（倍数）） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 了 该 筛选 的 可靠性 图 图 1B LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, o ktorom sa predtým uvádzalo, že podporuje progresiu rakoviny pľúc a pečene58, 59, 60, bol vylúčený (log2 (násobná zmena) <-0,58, p-hodnota <0,05, čo potvrdzuje robustnosť tohto skríningu (obr. .1b).
Spomedzi všetkých testovaných lncRNA bol tiež skrínovaný DARS-AS1, pričom tri príbuzné oligonukleotidy sgRNA boli významne znížené po 18 dňoch kultivácie, čo naznačuje, že knockdown tejto lncRNA viedol k zníženiu proliferácie rakoviny (obr. 1b).Tento výsledok bol ďalej podporený analýzou MTS v bunkách kolorektálneho karcinómu, ktorá ukazuje, že rýchlosť rastu knockdown buniek DARS-AS1 bola iba polovičná v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 1c) a bola v súlade s predchádzajúcimi správami o niekoľkých ďalších typoch rakoviny.: jasnobunkový karcinóm obličiek, karcinóm štítnej žľazy a nemalobunkový karcinóm pľúc51,52,53,55.Jeho funkcia a molekulárne mechanizmy pri kolorektálnom karcinóme však zostávajú nepreskúmané.Preto sme túto lncRNA vybrali na ďalšie štúdium.
Na štúdium expresie DARS-AS1 u pacientov sme komplexne analyzovali 10 327 vzoriek nádorov z projektu Cancer Genome Atlas (TCGA).Naše výsledky ukazujú, že DARS-AS1 je široko exprimovaný a významne upregulovaný v zdravých bunkách v rôznych nádoroch, vrátane adenokarcinómu hrubého čreva (COAD), karcinómu obličkových jasných buniek (KIRC) a karcinómu obličkových papilárnych buniek (KIRP)..Veľmi málo (obr. 1d a doplnkový obr. 1a, b). Analýza párových zdravých/nádorových vzoriek ďalej potvrdila signifikantne vyššiu expresiu DARS-AS1 v nádoroch urotelového karcinómu močového mechúra (BLCA), obličkového obličkového jasného bunkového karcinómu (KIRC), adenokarcinómu prostaty (PRAD), karcinómu skvamóznych buniek pľúc (LUSC) , karcinóm endometria maternicového telieska (UCEC), adenokarcinóm pľúc (LUAD), hepatocelulárny karcinóm pečene (LIHC), obličkový obličkový papilárny bunkový karcinóm (KIRP) a adenokarcinóm hrubého čreva (COAD) (hodnota p < 0,05) (obr. 1e–m) . Analýza párových zdravých/nádorových vzoriek ďalej potvrdila signifikantne vyššiu expresiu DARS-AS1 v nádoroch urotelového karcinómu močového mechúra (BLCA), obličkového obličkového jasného bunkového karcinómu (KIRC), adenokarcinómu prostaty (PRAD), karcinómu skvamóznych buniek pľúc (LUSC) , karcinóm endometria maternicového telieska (UCEC), adenokarcinóm pľúc (LUAD), hepatocelulárny karcinóm pečene (LIHC), obličkový obličkový papilárny bunkový karcinóm (KIRP) a adenokarcinóm hrubého čreva (COAD) (hodnota p < 0,05) (obr. 1e–m) .Analýza párových zdravých/nádorových vzoriek tiež potvrdila signifikantne vyššiu expresiu DARS-AS1 v nádoroch urotelového karcinómu močového mechúra (BLCA), čírych obličkových a obličkových karcinómoch (KIRC), adenokarcinómu prostaty (PRAD), skvamocelulárneho karcinómu pľúc (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , endometriálny karcinóm corpus uteri (UCEC), adenokarcinóm pľúc (LUAD), hepatocelulárny karcinóm pečene (LIHC), papilárnobunkový karcinóm obličky (KIRP) a adenokarcinóm hrubého čreva (COAD) (hodnota p < 0,05) (obr. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 透明 细胞癌 (KIRC) 、 前列 腺腺癌 (PRAD) 、 肺鳞状 细胞癌 (LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 的 的显着 更 高 ， 子宫体子宫 内膜 （（UCEC） ， 肺腺癌 （luad） ， 肝肝 （（liHC） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） <0,05））(图1e-m）).配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 DARS-OS1 在 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (PRAD) 、 细胞癌 细胞癌(LUSS) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 高 表达 ， 癌 （（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05））(图1e-m) .Analýza párových vzoriek zdravých/nádorov ďalej podporila úlohu DARS-AS1 v nádoroch urotelového karcinómu močového mechúra (BLCA), karcinómu obličkových buniek z jasných buniek (KIRC), adenokarcinómu prostaty (PRAD) a karcinómu skvamóznych buniek pľúc (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expresia v korpusovom karcinóme maternice (UCEC), pľúcnom adenokarcinóme (LUAD), hepatocelulárnom karcinóme (LIHC), renálnom papilárnom karcinóme (KIRP) a adenokarcinóme hrubého čreva (COAD) (p hodnota <0,05) (obrázok 1e-m).Celkovo tieto výsledky naznačujú, že DARS-AS1 je široko a vysoko exprimovaný v rôznych druhoch rakoviny.
Pretože DARS-AS1 a DARS (gén kódujúci antisense vlákno) zdieľajú rovnaký promótor a sú umiestnené vedľa seba, navrhli sme shRNA tak, aby špecificky porazila DARS-AS1, ale nie DARS (doplnkový obrázok 2a, b a doplnková tabuľka 2) .Okrem SW620 sme na štúdium účinnosti a funkcie knockdownu shRNA použili aj tri ďalšie bunkové línie vysoko exprimujúce DARS-AS1 (doplnková tabuľka 3).Naše výsledky ukázali, že všetky tri vyvinuté shRNA dosiahli aspoň 80% účinnosť knockdown DARS-AS1 s malým vplyvom na množstvo DARS mRNA (doplnkový obrázok 2c – f).Okrem toho sme zistili, že knockdown DARS-AS1 s týmito shRNA významne inhiboval rast buniek v bunkových líniách kolorektálneho karcinómu SW620 (49,7 %) a HCT116 (27,7 %), bunkovej línii rakoviny prsníka MBA-MD-231 (53,4 %).) a bunkovú líniu HepG2 hepatómu (92,7 % redukcia), ako aj ich schopnosť tvoriť neukotvené guľôčky (priemerné zníženie ~50,8 %, 44,6 %, 40,7 % a 75,7 % na bunkovú líniu) (obr. 2a, b).V SW620 výsledky testu tvorby kolónií ďalej potvrdili, že DARS-AS1 shRNA významne inhibovala bunkovú proliferáciu s priemerným poklesom približne 69,6 % (obr. 2c).
Účinok kontrolnej shRNA a DARS-AS1 shRNA na bunkovú proliferáciu (a) a tvorbu sféroidov (b) v bunkách SW620, HCT116, MBA-MD-231 a HepG2.c Účinok kontrolnej shRNA a DARS-AS1 shRNA na tvorbu kolónií v bunkách SW620.Bunková proliferácia (d), tvorba sféroidov (e) a tvorba kolónií (f) buniek SW620 nadmerne exprimujúcich DARS-AS1.Uvedené údaje sú priemer ± štandardná odchýlka troch experimentov.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 a*** p ≤ 0,001 pomocou dvojstranného Studentovho t-testu.
Na doplnenie štúdií straty funkcie sme ďalej vytvorili bunky SW620 nadmerne exprimujúce DARS-AS1 (doplnkový obrázok 2g).Nadmerná expresia DARS-AS1 významne zvýšila rast buniek (1,8-krát), tvorbu neukotvených sféroidov (1,4-krát) a tvorbu kolónií (3,3-krát) v bunkách SW620 (obr. 2d – f).Tento výsledok sme potvrdili použitím ďalšej bunkovej línie exprimujúcej DARS-AS1, A549.Táto zvýšená bunková proliferácia v dôsledku nadmernej expresie DARS-AS1 sa ďalej pozorovala v bunkách A549 (doplnkový obrázok 2h, i a doplnková tabuľka 3).Celkovo tieto štúdie ziskov a strát ukazujú, že DARS-AS1 podporuje proliferáciu rakovinových buniek in vitro.
Aby sme preskúmali základný mechanizmus, ktorým DARS-AS1 reguluje bunkovú proliferáciu, vykonali sme analýzu RNA pull-down, aby sme identifikovali jej potenciálnych partnerov viažucich proteíny.Výsledky RT-qPCR ukázali, že približne 86,2 % DARS-AS1 sa nachádza v cytoplazme buniek SW620 (doplnkový obrázok 3a).In vitro transkribovaná biotinylovaná DARS-AS1 alebo pseudoRNA sa potom inkubovala s lyzátmi buniek SW620, po čom nasledovala separácia SDS-PAGE.Následné farbenie striebrom ukázalo, že zreteľný pás (~38 kDa) bol významne obohatený vo vzorkách ťahania DARS-AS1, ale nie vo vzorkách falošnej RNA alebo guľôčok (obr. 3a).Tento pás bol identifikovaný ako proteín aktivujúci PKR (PACT) hmotnostnou spektrometriou (MS) a ďalej potvrdený imunoblotovaním v bunkových líniách SW620, HCT116 a HepG2 (obr. 3a, b).Obohatenie DARS a príbuzných proteínov PACT – PKR a TRBP – sa skúmalo aj pomocou analýzy RNA metódou Western blotting (WB).Výsledky ukázali, že sa nenašla žiadna priama interakcia medzi DARS-AS1 RNA a týmito tromi proteínmi (doplnkový obrázok 3b).Špecifická interakcia medzi DARS-AS1 a PACT bola ďalej potvrdená analýzou imunoprecipitácie RNA (RIP), ktorá ukázala, že DARS-AS1 bol významne obohatený o anti-PACT protilátky, ale nie o iné kontrolné RNA (obrázok 3c).Aby sa určilo, či DARS-AS1 interaguje priamo s PACT v neprítomnosti akýchkoľvek iných bunkových zložiek, uskutočnil sa in vitro test interferometrie na biovrstve (BLI) s použitím purifikovaného PACT.Biotínom značená DARS-AS1 alebo falošná RNA sa imobilizovala na streptavidínových (SA) biosenzoroch a potom sa inkubovala v kinetickom pufri obsahujúcom 1 uM PACT.Je pozoruhodné, že PACT sa silne viazal na DARS-AS1 (hodnota KD ~ 26,9 nM), ale nie na napodobňovanie RNA (obrázok 3d).Celkovo tieto výsledky demonštrujú priamu interakciu a vysokú afinitu medzi DARS-AS1 a PACT.
Analýza ťahu RNA identifikovala DARS-AS1 interagujúci s PACT v bunkách SW620.Vyššie uvedené farbenie príbuzných proteínov striebrom.Nižšie imunobloty sa uskutočnili s anti-PACT protilátkou.b RNA pull-down analýza sa uskutočnila v bunkách HCT116 (hore) a HepG2 (dole).Obohatenie PACT sa detegovalo imunoblotovaním.Testy imunoprecipitácie cRNA (RIP) sa uskutočnili v bunkách SW620 s použitím uvedených protilátok.d Väzbové krivky PACT k DARS-AS1 alebo kontrolnej RNA plnej dĺžky sa získali použitím interferometrie biovrstvy (BLI).RNA bola imobilizovaná na streptavidínovom biosenzore.Na meranie asociácie sa použil 1 uM PACT.Test vytiahnutia RNA sa uskutočnil s použitím biotinylovaného DARS-AS1 plnej dĺžky alebo skráteného (hore).Imunoblot zobrazujúci prijatý PACT (dole).f Purifikovaný označený PACT bol inkubovaný s biotinylovaným DARS-AS1 plnej dĺžky alebo skrátený (ako v e) pre in vitro RIP test.Extrahovaná RNA bola overená pomocou RT-qPCR.g Relatívna afinita rôznych fragmentov RNA pre PACT sa získala použitím interferometrie biovrstvy.Na analýzu sa použilo 100 nM RNA a 1 uM RAST.h In vitro RIP testy sa uskutočnili s použitím purifikovaného intaktného alebo skráteného značeného PACT.Extrahovaná RNA bola overená pomocou RT-qPCR.i Rýchlosť rastu buniek SW620 nadmerne exprimujúcich DARS-AS1, PACT alebo oboje.j Nadmerná expresia DARS-AS1 plnej dĺžky alebo skráteného DARS-AS1 v bunkách SW620 mala rôzne účinky na rast buniek.k Apoptóza bola detegovaná imunoblotovaním s anti-PARP protilátkou.l Knockout DARS-AS1 indukuje apoptózu buniek SW620, ako ukazuje prietoková cytometria.Uvedené údaje sú priemer ± štandardná odchýlka troch experimentov. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pomocou dvojstranného Studentovho t testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pomocou dvojstranného Studentovho t testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 pomocou dvojstranného Studentovho t-testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 pomocou dvojstranného Studentovho t-testu.
Potom sme vytvorili tri biotinylované fragmenty DARS-AS1 RNA in vitro transkripciou, aby sme identifikovali oblasť DARS-AS1 potrebnú na asociáciu PACT (obrázok 3e).Výsledky analýzy RNA ukázali, že každý fragment bol schopný interagovať s PACT, ale 3′-terminálna oblasť (384–768 nukleotidov označených A3) vykazovala viac ako 1–384 nukleotidov označených A1) (obr. 3e).Podobné výsledky boli pozorované v in vitro RIP teste s použitím rekombinantného PACT (obrázok 3f).V súlade s týmito výsledkami experimenty na viazanie imobilizovaných fragmentov RNA na PACT pomocou BLI tiež ukázali, že PACT má vyššiu afinitu k A3 (384–768 nt) (hodnota KD približne 94, 6 nM), zatiaľ čo takmer žiadne väzby s inými oblasťami.(obr. 3d).
Preskúmali sme tiež súvisiace väzbové oblasti v PACT.PACT obsahuje tri funkčné domény, z ktorých dve sú konzervované dvojvláknové domény viažuce RNA (dsRBD) a tretiu doménu (označenú ako D3), ktorá pôsobí ako aktivátor proteínových interakcií.Aby sme preskúmali väzbovú kapacitu lncRNA každej domény, vytvorili sme tri mutácie, ktoré odstránili každú z troch domén a vykonali in vitro RIP test.Naše výsledky ukázali, že delécia tretej domény (D3) PACT významne znížila jeho interakciu s DARS-AS1 (0,11-násobne v porovnaní s intaktným PACT) v porovnaní s ďalšími dvoma mutáciami (obr. 3h), ukázalo sa, že uvoľnenie z D3 interagovalo s DARS.-AC1.Celkovo tieto výsledky naznačujú, že interakcia medzi DARS-AS1 a PACT sa môže vyskytnúť predovšetkým prostredníctvom 3' konca DARS-AS1 a domény D3 PACT.
Poznamenali sme, že DARS-AS1 nemal žiadny vplyv na expresiu PACT a PACT nemal žiadny vplyv na DARS-AS1 (doplnkový obrázok 3c).Potom sme skúmali účinok knockdownu PACT na rast buniek.Na rozdiel od DARS-AS1 rástli relatívne bunky 1,5–3 krát rýchlejšie, keď bol PACT zrazený (doplnkový obrázok 3d).Výsledky testu tvorby kolónií ukázali, že bunky vytvorili 2-3-násobné kolónie po ošetrení shRNA pomocou PACT (doplnkový obrázok 3e).Aby sme otestovali, či DARS-AS1 reguluje bunkovú proliferáciu prostredníctvom PACT, vytvorili sme bunky SW620 nadmerne exprimujúce PACT, DARS-AS1 alebo oboje.Nadmerná expresia PACT ukázala významnú inhibíciu bunkovej proliferácie (obrázok 3i).Zatiaľ čo nadmerná expresia DARS-AS1 per se významne podporovala bunkovú proliferáciu, nebol žiadny významný rozdiel v rýchlosti rastu buniek nadmerne exprimujúcich DARS-AS1 a PACT.Tieto výsledky naznačujú, že PACT môže pôsobiť proti zvýšenej proliferácii spôsobenej nadmernou expresiou DARS-AS1.
Pretože rôzne oblasti DARS-AS1 majú rôzne schopnosti viazania PACT, skúmali sme ich relatívny vplyv na proliferáciu buniek rôznou nadmernou expresiou fragmentov DARS-AS1.V porovnaní s ďalšími dvoma fragmentmi bol DARS-AS1 nadmerne exprimovaný na 3′ konci (384–768 nt), hlavnej oblasti súvisiacej s PACT v DARS-AS1, ktorá mala najvyššiu schopnosť stimulovať bunkovú proliferáciu (obr. 3j).Tieto výsledky naznačujú pozitívnu koreláciu medzi väzbovou kapacitou a biologickou funkciou DARS-AS1.
Uvádza sa, že PACT je proapoptotický proteín19.Preto sme skúmali účinok DARS-AS1 na apoptózu.Ako sa očakávalo, knockdown DARS-AS1 významne zvýšil štiepenie PARP v bunkách SW620 a zvýšil podiel buniek pozitívnych na anexín V v bunkových líniách SW620, HCT116, HepG2 a MBA-MD-231 (obr. 3k).3).3f – h), čo naznačuje, že antiapoptotický účinok DARS-AS1 v rakovinových bunkách je opačný ako funkcia PACT indukujúca apoptózu.Celkovo tieto výsledky naznačujú, že mechanizmus onkogénnej funkcie DARS-AS1 môže byť prostredníctvom inhibície funkcie PACT.
Ďalej sme skúmali funkčné dôsledky asociácie DARS-AS1-PACT.Uvádza sa, že PACT aktivuje PKR prostredníctvom priamej interakcie, ktorá následne zvyšuje fosforyláciu eIF2a, čo spôsobuje translačnú deléciu a apoptózu17.Najprv sme skúmali, či DARS-AS1 ovplyvňuje bunkovú lokalizáciu PACT a PKR.Konfokálna fluorescenčná mikroskopia ukázala, že PACT a PKR boli vysoko kolokalizované v bunkách SW620 s priemerným Pearsonovým korelačným koeficientom 0,72.Medzitým nadmerná expresia DARS-AS1 významne znížila spoločnú lokalizáciu PACT a PKR (priemerný Pearsonov korelačný koeficient 0,61) (obrázok 4a).Aby sme zistili, či DARS-AS1 môže modulovať interakciu PACT-PKR, uskutočnili sme koimunoprecipitačný (co-IP) test s anti-PACT protilátkou v bunkových lyzátoch SW620.PKR bola vysoko obohatená o anti-PACT v kontrolných bunkách, zatiaľ čo regenerácia PKR bola významne znížená v lyzátoch z buniek nadmerne exprimujúcich DARS-AS1 (obr. 4b).Purifikované značené PACT a PKR sa použili na in vitro proteínové väzbové testy.V súlade s tým tie, ktoré poskytli DARS-AS1, ale žiadnu kontrolnú RNA, vykazovali potlačenú interakciu PACT-PKR (obrázok 4c).Všetky výsledky ukázali, že DARS-AS1 narušil komunikáciu PACT a PKR.
pomocou konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie sa pozorovala spoločná lokalizácia PACT a PKR v kontrolných bunkách alebo bunkách nadmerne exprimujúcich DARS-AS1.Jadrá boli zafarbené DAPI.Štatistické výsledky boli získané zo 16 fotografií.b Koimunoprecipitácia (co-IP) s použitím anti-PACT protilátky v bunkových lyzátoch kontrolných buniek SW620 alebo buniek nadmerne exprimujúcich DARS-AS1.c Označené PACT, purifikované PKR a transkribované in vitro pomocou DARS-AS1 alebo falošnej RNA sa inkubovali na analýzu väzby proteínov in vitro.Na imunoprecipitáciu sa použili anti-flag protilátky.d Imunobloty s uvedenými protilátkami sa uskutočnili v bunkách SW620 a HCT116 transfekovaných kontrolnou shRNA alebo DARS-AS1-shRNA, po ktorej nasledovalo hladovanie v sére.e Úrovne expresie DARS-AS1 zmenili bunkovú citlivosť na thapsigargin.Bunky SW620 boli transfekované DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 nadmerne expresným plazmidom alebo kontrolným plazmidom.Bunky boli ošetrené thapsigarginom počas 48 hodín a životaschopnosť buniek bola stanovená použitím činidla MTS.f In vitro transkribovaný DARS-AS1 alebo falošná RNA a purifikovaný PACT sa použili na in vitro aktivačný test a detekciu imunoblotom.g Imunobloty s použitím týchto protilátok sa uskutočnili na bunkách SW620-ctrl (vľavo) alebo bunkách nadmerne exprimujúcich mutanty PKR (vpravo).Tieto bunky sa potom transfekovali kontrolnou shRNA alebo DARS-AS1-shRNA, po čom nasledovalo hladovanie v sére.h Prietoková cytometria ukázala, že inaktivácia mutantnej PKR kompenzovala apoptózu indukovanú DARS-AS1 v bunkách SW620.Imunobloty s uvedenými protilátkami sa uskutočnili v bunkách SW620 (vľavo) alebo HCT116 (vpravo).Bunky transfekované kontrolnou shRNA alebo DARS-AS1 shRNA sú zbavené séra a sú doplnené 100 nM inhibítorom PKR C16 alebo DMSO.Mierka = 5 um.Uvedené údaje sú priemer ± štandardná odchýlka troch experimentov.* p ≤ 0,05 dvojstranný Studentov t-test.
Všeobecne sa verí, že akonáhle PACT interaguje s PKR17, môže byť indukovaná PKR fosforylácia na Thr451.Naše výsledky ukázali, že hladina fosforylácie PKR bola významne zvýšená v knockdown bunkách DARS-AS1 po hladovaní v sére (obr. 4d a doplnkový obrázok 4a).V súlade s tým sme zistili, že fosforylácia eIF2a, hlavného substrátu PKR, bola tiež významne zvýšená DARS-AS1 shRNA (obr. 4d a doplnkový obrázok 4a).Thapsigargin je stresor ER, ktorý spôsobuje, že ER uvoľňuje Ca2+.Uvádza sa, že liečba thapsigarginom indukuje expresiu a aktiváciu PACT, ktorý ďalej interaguje a aktivuje PKR, čo vedie k apoptóze zvýšením fosforylácie eIF2a18,61.Tu sme použili thapsigargin ako stimulátor dráhy PACT / PKR, aby sme zistili, či DARS-AS1 môže pomôcť bunkám prekonať stres inhibíciou dráhy PACT / PKR.Pozorovali sme, že hladina expresie DARS-AS1 pozitívne korelovala s bunkovou rezistenciou na thapsigargin.Bunky SW620 nadmerne exprimujúce DARS-AS1 prežili lepšie, keď boli ošetrené thapsigarginom, zatiaľ čo bunky s knockdown DARS-AS1 sa stali náchylnejšími (obr. 4e).V súlade s týmito výsledkami nadmerná expresia DARS-AS1 znížila fosforyláciu PKR indukovanú tapsigargínom (doplnkový obrázok 4b).Na rozdiel od toho, po ošetrení thapsigarginom boli PKR a eIF2a fosforylované vo vyššej miere v knockdown bunkách DARS-AS1 v porovnaní s kontrolnými bunkami (doplnkový obrázok 4b).Je zaujímavé, že thapsigargin indukoval expresiu DARS-AS1 spôsobom závislým od dávky, čo môže naznačovať protistresovú funkciu DARS-AS1 (doplnkový obrázok 4c).Okrem toho sme vykonali in vitro aktivačné testy na potvrdenie týchto pozorovaní.Stručne, PKR sa purifikoval z bunkových lyzátov s použitím anti-PKR protilátky, potom sa inkuboval s rekombinantným PACT a DARS-AS1 transkribovaným in vitro.Po enzymatickej reakcii sa pomocou WB detegovala fosfo-PKR.Naše výsledky ukázali, že fosforylácia PKR bola významne inhibovaná DARS-AS1, ale nie kontrolnou RNA (obrázok 4f).Tieto výsledky in vitro a in vivo naznačujú, že DARS-AS1 inhibuje aktiváciu PKR sprostredkovanú PACT.Súčasne sme tiež pozorovali zníženie obnovy PACT v prítomnosti DARS-AS1 (obrázok 4f).Tento výsledok je v súlade s výsledkami in vitro testu väzby proteínov (obrázok 4c) a opäť ilustruje blokujúcu funkciu DARS-AS1 pre asociáciu PACT-PKR.
Ser246 a Ser287 v doméne D3 PACT sú potrebné na aktiváciu PKR pri bunkovom strese.Substitúcia dvoch serínových zvyškov za alanín poskytla mutantný PACT (mutD), ktorý aktivoval PKR v neprítomnosti stresu, a substitúcia za alanín (mutA) obrátila protokol.Pretože sme preukázali dôležitosť tejto domény v priamej asociácii s DARS-AS1, vytvorili sme tieto dva mutanty PACT, aby sme otestovali, či tieto zvyšky môžu byť tiež zapojené do interakcie s DARS-AS1.Je zaujímavé, že obidva mutanty stratili schopnosť viazať sa na DARS-AS1 (doplnkový obrázok 4d), čo naznačuje, že na účinnú interakciu s DARS-AS1 môže byť potrebná úplná štruktúra proteínu PACT.
Okrem toho naše výsledky tiež naznačujú, že inhibíciu bunkovej proliferácie indukovanú DARS-AS1-shRNA možno čiastočne obnoviť nadmernou expresiou dominantného negatívneho mutantu PACT (PACTmutA) alebo dominantného negatívneho mutantu PKR (PKRmut) (doplnkový obrázok 4e. e).Nadmerná expresia dominantne negatívnych mutantov PKR znížila fosforyláciu PKR indukovanú knockdownom DARS-AS1, ako aj fosforyláciu eIF2a v bunkách zbavených séra (obr. 4g).Dôležitejšie je, že podiel apoptotických buniek indukovaných knockdownom DARS-AS1 bol tiež znížený v bunkách nadmerne exprimujúcich PKRmut (obr. 4h a doplnkový obrázok 4g).Inhibícia aktivity PKR kinázy tiež zhoršuje funkciu DARS-AS1, pretože výsledky ukázali, že knockdown DARS-AS1 zriedka spustil fosforyláciu PKR a eIF2a, keď boli bunky ošetrené inhibítorom C16 špecifickým pre PKR (obr. 4i a doplnkový obrázok 4h).).Celkovo naše výsledky naznačujú, že DARS-AS1 podporuje bunkovú proliferáciu, aspoň čiastočne, inhibíciou aktivácie PKR sprostredkovanej PACT.
Aby sme ďalej preskúmali úlohu DARS-AS1 pri tumorigenéze, uskutočnili sme in vivo experimenty s použitím myšacieho xenoštepového modelu. Výsledky ukazujú, že knockdown DARS-AS1 dramaticky znížil rast nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obr. 5a). Výsledky ukazujú, že knockdown DARS-AS1 dramaticky znížil rast nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obr. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей) (мышей) (мышей) (мышей). Výsledky ukazujú, že knockdown DARS-AS1 drasticky znižuje rast nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obrázok 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001））(囀5a）)结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001））㛾5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли опухоли у мыраней у мышаней Výsledky ukázali, že knockdown DARS-AS1 významne znížil rast nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obrázok 5a).V skupine s knockdownom DARS-AS1 teda došlo k významnému zníženiu priemerného objemu nádoru o približne 72,9 % a priemernej hmotnosti nádoru o približne 87,8 % (obrázok 5b-d).Tieto výsledky silne naznačujú, že DARS-AS1 môže významne podporovať rast nádoru in vivo.
Účinky knockdownu ad DARS-AS1 na kolorektálnu onkogenézu u nahých myší.Sú znázornené rastové krivky (a), veľkosť nádoru (b), hmotnosť (c) a snímky nádoru (d).Chybové stĺpce predstavujú ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, pomocou dvojstranného Studentovho t testu. n = 10. ****p < 0,0001, pomocou dvojstranného Studentovho t testu. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 dvojstranný Studentov t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 za по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 dvojstranný Studentov t-test.Kaplan-Meier analyzoval koreláciu medzi hladinami expresie DARS-AS1 a celkovým prežitím u pacientov s UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM a LGG.Vysoké hladiny expresie DARS-AS1 u pacientov boli v horných 50 %;nízka hladina expresie DARS-AS1 u pacientov bola v spodných 50 %.p-hodnoty boli stanovené pomocou log rank testu.f Navrhovaný model, v ktorom DARS-AS1 reguluje dráhu PACT-PKR a rast nádoru.
Aby sme lepšie porozumeli klinickému vplyvu DARS-AS1, skúmali sme koreláciu medzi jeho expresiou a prežitím pacienta.Analýzou súboru údajov TCGA sme zistili, že vyššia expresia DARS-AS1 bola spojená s uveálnym melanómom (UVM), renálnou chromofóbiou (KICH), renálnym papilárnym karcinómom (KIRP), mezoteliómom (MESO), multiplexom.Nižšie prežitie bolo významne spojené s morfózou glioblastómu (GBM) a pacientmi s gliómom mozgu nízkeho stupňa (LGG) (obrázok 5e).Tieto výsledky naznačujú, že DARS-AS1 môže hrať dôležitú úlohu v klinickej progresii nádoru a môže byť potenciálnym prediktívnym biomarkerom pri viacerých rakovinách.
V tejto štúdii sme pomocou rozsiahleho funkčného skríningu CRISPRi zistili, že DARS-AS1 lncRNA prekonáva stres rakovinových buniek reguláciou dvoch kľúčových stresových reagujúcich osôb, PACT a PKR.DARS-AS1 priamou interakciou s PACT inhiboval aktiváciu PKR sprostredkovanú PACT, čím zabránil apoptotickej bunkovej smrti a podporil bunkovú proliferáciu (obr. 5f).Upregulácia DARS-AS1 bola pozorovaná pri viacerých typoch rakoviny, čo naznačuje, že jej funkcia podpory prežitia rakovinových buniek v stresových podmienkach môže byť široko použiteľná na viaceré typy rakoviny.
PACT bol identifikovaný ako PKR aktivátorový proteín a PACT sprostredkovaná PKR aktivácia hrá dôležitú úlohu v stresových reakciách reguláciou transkripcie, translácie, apoptózy a iných dôležitých bunkových procesov62.Po celé desaťročia sa robili pokusy pochopiť rakovinovo špecifickú reguláciu kaskády PACT-PKR.Tu naša štúdia odhalila odlišný mechanizmus regulácie PACT-PKR v rakovinových bunkách prostredníctvom bunkovej lncRNA DARS-AS1, ktorá sa priamo viaže na PACT, blokuje interakciu PACT-PKR, inhibuje aktiváciu PKR a fosforyláciu eIF2α, čím inhibuje stresom indukovanú apoptózu a stimulácia prípadnej proliferácie rakoviny.bunky.Tento objav vrhá svetlo na potenciálne ciele lncRNA pre prognózu a liečbu rakoviny.
Naše údaje ukázali, že knockdown DARS-AS1 senzibilizuje bunky na hladovanie v sére s významným zvýšením fosforylovaných PKR a eIF2a.Tieto výsledky naznačujú, že DARS-AS1 podporuje prežitie rakovinových buniek v drsných podmienkach inhibíciou aktivity PACT/PKR.Niekoľko ďalších nekódujúcich RNA, ako napríklad ASPACT a nc886, je tiež zapojených do osi PACT / PKR downreguláciou mRNA PACT48 alebo reguláciou autofosforylácie väzbou na PKR49, 50, 64.Medzi nimi DARS-AS1 pôsobí ako disruptor asociácie PACT-PKR.Táto štúdia obohacuje naše chápanie regulácie osi PACT/PKR a úlohy lncRNA pri stresových reakciách.
PACT obsahuje tri samostatné domény.Každá z prvých dvoch dsRBD je dostatočná na dosiahnutie vysokej afinity väzby PACT na PKR, zatiaľ čo tretia doména (D3) je potrebná na aktiváciu PKR in vitro a in vivo.Naša štúdia ukázala, že DARS-AS1 prednostne interaguje s doménou D3 (obr. 3h).Vzhľadom na veľkú veľkosť lncRNA (768 nukleotidov) môže väzba DARS-AS1 na D3 fyzicky inhibovať interakciu medzi doménou PACT dsRBD a PKR, čím blokuje spojenie PACT a PKR.Bodové mutácie PACT, ktoré nahradili Ser246 a Ser287 v D3 alanínom alebo aspartátom, narušili jeho väzbovú afinitu k DARS-AS1, čo poukazuje na dôležitosť celkových štrukturálnych a elektrických vlastností D3 v ich spojení.Ďalšie podrobnosti o tomto mechanizme budú potrebné v budúcnosti s použitím presnejšej biochemickej analýzy a štrukturálnej analýzy PACT s vysokým rozlíšením.
Predchádzajúce štúdie uviedli, že DARS-AS1 podporuje bunkovú proliferáciu prostredníctvom niekoľkých mechanizmov51, 52, 53.V jednom príklade výskumníci pozorovali, že DARS-AS1 upreguloval svoj gén DARS kódujúci antisense proteín zacielením miP-194-5p v bunkách rakoviny obličiek.V tejto štúdii však knockdown DARS-AS1 mal malý vplyv na transkripciu DARS pri viacerých typoch rakoviny, vrátane aspoň rakoviny hrubého čreva, prsníka a pečene.Pretože lncRNA vykazujú bunkovo ​​a tkanivovo špecifické expresné vzory, funkčné mechanizmy nemusia byť zachované medzi typmi rakoviny, čo môže prispieť k tomuto rozporu medzi našimi pozorovaniami a predchádzajúcimi hodnoteniami rôznych druhov rakoviny.Na objasnenie špecifických mechanizmov rôznych fyziologických a patologických procesov sú potrebné špeciálne štúdie.
Analýza klinických údajov ukázala, že expresia DARS-AS1 v nádoroch nepriamo koreluje s prežitím pacientov s rakovinou, čo podčiarkuje dôležitosť osi DARS-AS1/PACT/PKR v prognóze rakoviny.Na záver, naša štúdia ukazuje, že DARS-AS1 je regulátorom signálnej osi PACT/PKR, podporuje proliferáciu rakovinových buniek a inhibuje apoptózu počas stresovej reakcie, čo poskytuje ďalšiu líniu výskumu a je zaujímavé pre budúci výskum potenciálnej liečby. .
Ľudské bunkové línie SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 a HEK293T boli získané z National Cell Line Resource Infrastructure v Číne.Všetky bunky sa udržiavali v médiu DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) doplnenom 10 % FBS (Gemini, Brooklyn, NY) a 1 % penicilín-streptomycín (Thermo Fisher Scientific) pri 37 °C, 5 % CO2.inkubátor.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-p-tubulín, CST (2128);normálny myší IgG, CST (5415S);normálny králičí IgG, CST (2729S).Protilátky boli zriedené 1:1000 v PBST pre Western blotting a 1:100 pre IP.
sgRNA boli vyvinuté pomocou verejne dostupného nástroja s názvom CRISPR-ERA66.Použili sme predvolené parametre nástroja na vývoj sgRNA a algoritmus vypočítal väzbové miesta sgRNA v oblasti 3 kb.so zameraním na TSS.Súbory sgRNA oligonukleotidov boli syntetizované v CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) a klonované do humanizovaných pgRNA plazmidov (Addgene #44248).Celkom 12 ug spojeného humanizovaného plazmidu pgRNA, 7,2 ug psPAX2 (Addgene č. 12260) a 4,8 ug pMD2.G (Addgene č. 12259) sa kotransfekovalo do 5 x 106 HEK293T v 10 cm miskách DNA Refectagent Transfegent bunky (CWBIO, Peking, Čína) podľa pokynov výrobcu.Supernatanty obsahujúce vírus sa zhromaždili 48 a 72 hodín po transfekcii a prefiltrovali sa cez 0,45 um filter.Na skríning boli bunky SW620 exprimujúce fúzny proteín dCas9/KRAB získané vírusovou transdukciou.Modifikované bunky SW620 boli infikované vírusovou knižnicou v štyroch nezávislých infekčných experimentoch pri MOI 0,1-0,3 a boli odoberané vzorky s 2 ug/ml puromycínu (Sigma, St. Louis, MO) počas 2 dní.Potom sa bunky kultivovali 18 dní in vitro s minimálnym pokrytím knižnice 500 buniek/sgRNA na skríning.
Genómová DNA sa extrahovala podľa pokynov súpravy QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Nemecko; 51183).Celkovo sa na vytvorenie knižnice použilo 100 μg genómovej DNA na biologickú repetíciu.Oblasť sgRNA bola amplifikovaná dvoma cyklami PCR a spojená s čiarovým kódom.
Produkty PCR sa purifikovali pomocou gélu NucleoSpin® a purifikačnej súpravy PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Nemecko; 740609.250) a kvantifikovali sa pomocou súpravy na detekciu dvojvláknovej DNA Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Na meranie bunkovej proliferácie sa použil test MTS.Bunky sa naočkovali na 96-jamkové platne pri počiatočnej hustote 2000 buniek/jamku.Relatívny počet buniek sa meral denne v uvedenom čase celkovo 4-6 dní.Pre každú jamku sa 20 ul činidla MTS (Promega) zriedilo 100 ul DMEM, inkubovalo sa s bunkami počas 4 hodín pri 37 ° C a potom sa merala OD490.
Schopnosť neukotveného rastu bola objavená analýzou tvorby gúľ.Stručne, 2000 buniek transfekovaných shRNA DARS-AS1 alebo kontrolnou shRNA sa kultivovalo na mikrodoštičkách s ultra nízkou priľnavosťou (Corning) s výmenou média každé 4 dni.Sféroidy sa spočítali po 14 dňoch.Na test zosilnenia sa použilo 500 buniek transfekovaných plazmidom nadmernej expresie DARS-AS1 alebo kontrolným plazmidom, inak bola metóda nezmenená.
RNA bola transkribovaná pomocou T7 RNA polymerázy a biotín-16-UTP (Roche 1138908910) podľa inštrukcií Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Tu použité priméry sú uvedené v doplnkovej tabuľke 4.
Oblasti PACT alebo PKR kódujúce proteín boli klonované do pET15b (Addgene #73619) a transformované do BL21(DE3).Baktérie sa inkubovali cez noc v LB s ampicilínom a potom sa 100-násobne zriedili čerstvým LB.Keď OD600 média dosiahla 0,8, pridal sa 1 mM IPTG na vyvolanie expresie proteínu.Po inkubácii cez noc s jemným trepaním (250 otáčok za minútu pri 20 °C) sa bunková peleta zozbierala centrifugáciou (4000 otáčok za minútu, 10 minút, 4 °C).Resuspendujte bunkovú peletu v lyzovacom pufri (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) a inkubujte na ľade 30 minút, potom sonikujte (15 minút, 5 s zapnuté/vypnuté, na ľade) a odstreďte (13 000 otáčky za minútu)., 30 minút, 4 °C).Supernatant sa potom naniesol na živicu Ni-NTA (QIAGEN) 3-krát pri 4 °C, premyl sa 4-krát premývacím pufrom (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) a eluoval sa 3-krát, s celkovým 10 ml elučného pufra (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCI, 300 mM imidazol).Vyčistený proteín sa určil pomocou WB a koncentrácia sa určila pomocou súpravy na stanovenie proteínov Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP testy sa uskutočnili tak, ako bolo opísané vyššie, s modifikáciami.Stručne, 1x RIP pufor (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, inhibítor RNAsín ribonukleázy (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteáza) lyzuje 1 cytostatický kokteil 1 x (Roche, 1 mM DTT) a centrifugujte pri 13 000 ot./min. počas 15 minút pri 4 °C.Supernatant sa potom inkuboval s magnetickými guľôčkami proteínu A+G (Millipore) konjugovanými s 5 ug anti-PACT protilátky (Abeam) alebo IgG (CST).Guľôčky sa premyli 5-krát 5x RIP pufrom, potom sa štiepili proteinázou K (NEB).RNA bola extrahovaná Trizolom a stanovená pomocou RT-qPCR.Priméry sú uvedené v doplnkovej tabuľke 5.
In vitro RIP test sa uskutočnil podľa modifikovaného štandardného RIP testovacieho protokolu.Celkom 5 pmol in vitro transkribovanej RNA sa zriedilo 1x s RIP pufrom a anelovalo sa inkubáciou pri 65 °C počas 5 minút, po čom nasledovalo pomalé ochladenie na teplotu miestnosti.Z E. coli sa purifikovalo celkom 5 pmol intaktných alebo mutovaných flag-značených PACT proteínov.Inkubujte s renaturovanou RNA 2 hodiny pri 4 °C a postupujte podľa vyššie uvedeného postupu pre analýzu RIP pre anti-flag IP.
Na analýzu predlžovania RNA sa 1 x 107 buniek lýzovalo 1 x RIP pufrom.Po centrifugácii pri 13 000 otáčkach za minútu počas 15 minút pri 4 ° C sa supernatant vopred ošetril 30 ul magnetických guľôčok streptavidínu (Beckman) počas 2 hodín pri 4 ° C.Purifikovaný lyzát bol potom dodaný s kvasinkovou tRNA a inkubovaný so 40 pmol renaturovanej RNA cez noc pri 4 °C, potom ďalšie 2 hodiny a bolo pridaných 20 ul nových streptavidínových magnetických guľôčok blokovaných BSA.Premývací krok pozostával zo 4-krát s 5x RIP pufrom a 4-krát s 1x RIP pufrom.Zodpovedajúce proteíny boli eluované biotínovým elučným pufrom (25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 12,5 mM D-biotín, PMSF) a separované na NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel (Invitrogen).Po farbení striebrom (Beyotime Biotechnology) sa vyrezali určité pásy a analyzovali sa pomocou MS.
Na testovanie interakcie medzi PACT a PKR sa uskutočnila Co-IP analýza.Stručne, lyzáty supernatantu sa pripravili inkubáciou 1 x 107 lyzovaných buniek v 1 x RIP pufri, po čom nasledovala centrifugácia pri 13 000 ot./min. počas 15 minút pri 4 °C.Lyzáty boli naplnené magnetickými guľôčkami proteínu A + G, konjugované s 5 ug anti-PACT protilátky a jemne rotované cez noc pri 4 °C.Guľôčky sa premyli 3-krát 5 x RIP pufrom, dvakrát 1 x RIP pufrom a eluovali sa 1 x SDS pufrom.Získaný proteín sa analyzoval pomocou SDS-PAGE gélu a detegoval sa pomocou WB.
Dva pmol označeného PACT a 1 pmol PKR sa purifikovali z E. coli.Zrieďte v 1× RIP pufri a inkubujte s 10 pmol renaturovanej RNA 2 hodiny pri 4 °C.Potom boli inkubované s proteínom A+G s magnetickými guľôčkami konjugovanými s anti-značenou protilátkou počas ďalších dvoch hodín.Guľôčky sa potom štyrikrát premyli 1 x RIP pufrom a eluovali sa 1 x SDS pufrom.Výsledné PACT a PKR boli detekované WB.